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糖尿病小鼠脑组织超磷酸化及其机理研究 |
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from hyperphosphorylation.
【Key words】 Diabetic encephalopathy Tau protein Hyperphosphorylation Mice
(Chin J Endocrinol Metab, 1999,15:38-40)
糖尿病和痴呆在老年人群中发病率较高，糖尿病病人常有认知功能障碍，但与痴呆之间的关系并不清楚，Ott等研究了55～99岁的老年人6 330例，发现糖尿病724例(11.4%)，265例痴呆病人中59例患有糖尿病(22.3%)，经过多元回归分析，校正年龄和性别，表明糖尿病和痴呆之间存在正相关〔1〕。Leibson等报道了1 455 例成年发 病的糖尿病病人中981人经一年观察后，101人产生了痴呆，其中77例为老年性痴呆(AD)，经统计学处理表明这些糖尿病人对痴呆的危险性明显增加，相对危险度(RR)=1.66 95%可信区间(CI)为1.34～2.05〔2〕。Sinclair等的研究也表明糖尿病人出现痴呆明显增加(P＜0.01)〔3〕，并出现较为严重的认知功能损害和较高程度的生活依赖(P＜0.01)。这些研究表明糖尿病和痴呆密切相关，但是这些关系的分子学基础尚未见报道。
老年痴呆在病理上以脑神经元大量出现神经元纤维缠结(NFT)和老年斑(SP)为特征，神经元内每分子正常Tau蛋白含2分子磷酸，能与微管蛋白结合形成微管，而微管是神经元存活所必需的结构。在AD脑中，Tau蛋白被过多磷酸化，形成成对螺旋细丝(Paired Helical Filaments, PHF)，继之糖化，最终形成NFT。因此，Tau蛋白过多磷酸化是AD最早出现的分子水平上的异常。但是Tau磷酸化的程度取决于使蛋白质磷酸化的激酶和使蛋白质脱磷酸化的磷酸酯酶之间的平衡〔4〕。我们为探讨糖尿病与AD之间的关系，研究了糖尿病小鼠脑神经元Tau蛋白的磷酸化及其相关的酶PP-2B，以便为研究糖尿病是AD的危险因素提供分子学基础。SP是β淀粉样肽(β-Amyloid, Aβ)沉积而逐渐形成的，Aβ是其前体蛋白(Amyloid Precusor Protein, APP)翻译后加工的产物。然而APP的319-335肽段(APP17肽)具有促进神经元轴突生长和突触形成的作用〔5〕。基于上述生物活性，我们合成了APP17肽并应用于糖尿病小鼠，观察它对Tau蛋白过度磷酸化的影响，以开拓它防治糖尿病脑病和AD的可能性。
材料和方法
一、实验动物及动物模型复制
昆明小鼠，雄性，体重32～37克，购自医科院药研所，随机分为三组：正常对照组(C组)、糖尿病对照组(DM组)、APP17肽防治组(APP17P+DM组)。APP17肽由本室用固相法合成，HPLC纯化。APP17P+DM组于糖尿病造模前两周起至STZ给药后4周皮下注射APP17肽，每次0.34μg/只，每天一次。STZ购自Sigma公司，用0.1mol/L,pH4.4的柠檬酸缓冲液将STZ配制为20g/L，用前新鲜配制，小鼠禁食12小时后按200mg/kg体重剂量腹腔注射，三天后用血糖仪测尾部非禁食血糖，大于15mmol/L者认为糖尿病模型复制成功。成模后DM组14只，C组小鼠15只，APP17P+DM组15只。
二、免疫组化染色
给STZ 4周后，小鼠用水合氯醛按4ml/kg体重剂量腹腔注射，待麻醉后开胸暴露心脏，经左心室插管快速灌注生理盐水，同时剪开右心耳，待肝脏变白后，改灌4%的多聚甲醛固定液，动物僵直为满意，取脑投入30%的蔗糖多聚甲醛溶液后固定。待脑下沉后，行冰冻切片，厚度为40μm，进行AT-8、Tau-1、蛋白磷酸酶(Protein Phosphatase-2B，PP-2B)及用PP-2B脱磷酸后的Tau-1免疫组化染色〔6〕。AT-8抗体购自Innogenetics公司，Tau-1抗体和PP-2B抗体为美国K. Iqbal教授赠送。Sp免疫组化试剂盒购自Zymed Laboratories公司，批号为70436475。按说明书进行实验，阴性对照不加一抗，以正常血清代替。
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