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利用免疫聚合酶链反应探讨HBsAg阴性 HBV DNA阳性的形成原因 |
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彭晓谋 姚集鲁 郭万里 陈雪娟
免疫聚合酶链反应(immuno-PCR)结合了PCR的高度敏感性和免疫技术能检测各种抗原物质的特性，已被应用于癌蛋白、细胞受体及其它微量抗原物质的检测［1，2］。免疫PCR检测HBsAg的敏感性远远高于ELISA法［3］。临床检验中常出现HBsAg(-)/HBV DNA(+)的现象，约占临床检验患者的10%～25%［4］，其形成原因尚不十分清楚。目前常采用ELISA检测HBsAg，PCR检测HBV DNA。这两种方法的敏感性差别极大，不能全面正确阐明上述现象的形成原因。本研究利用高度敏感的免疫PCR提高HBsAg检测的敏感性，并对临床检验中出现HBsAg(-)/HBV DNA(+)的原因作进一步探讨。
材料与方法
一、材料
(一) 病例 452例有HBV DNA(PCR法)、HBsAg、HBeAg、抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc等资料的血清标本收集于1996年1月至1997年5月，均系本研究室的临检标本。全部病例均为HBV DNA阳性，23例为HBsAg阴性。23例HBsAg阴性者中，有16例2～8月前收到了另一血清标本。
(二) 试剂 抗-HBs单抗本研究室自制，多抗(羊抗)系DAKO公司产品。Biotin-二抗(兔抗羊IgG抗体)系GIBco BRL公司产品；439bp Biotin-DNA片段为自行研制；亲合素(Extra Avidin)系Sigma产品。
二、方法
(一) 免疫PCR检测HBsAg 抗-HBs单抗常规包被微量板，洗去过量的抗体后，加血清于37°C温育30分钟，再依次加入抗-HBs多抗、Biotin-二抗、亲合素和Biotin-DNA。彻底清洗后加入30μl蒸馏水，95°C DNA变性，取5μl进行PCR扩增。PCR条件和引物序列见参考文献［5］。产物为203bp。采用4份HBsAg和HBV DNA均阳性的不同稀释(5倍)血清来评价免疫PCR的敏感性。
(二) RIA检测HBsAg 23份HBsAg(-)/HBV DNA(+)血清同时采用RIA复查HBsAg。
(三) 复查HBV DNA 23份HBs-Ag(-)/HBV DNA(+)血清采用S基因和X基因区引物分别进行PCR扩增，复查HBV DNA。
(四) 单链构型多态性分析 双份血清若均为HBV DNA阳性则进行单链构型多态性(SSCP)分析，了解HBV DNA的突变情况。
结果
一、免疫PCR的敏感性
对梯度血清进行检测时发现，免疫PCR的敏感性高于RIA法5～125倍。
二、RIA和免疫PCR检测HBsAg
23例HBsAg(-)/HBV DNA(+)患者中，免疫PCR 检出12例，阳性率为52.2%，RIA检出10例，阳性率为43.5%。
三、复查HBV DNA
临检所用引物来自S基因，为了评价PCR污染在HBsAg(-)/HBV DNA(+)形成中的意义，本研究首先采用与临检同样的方法(S区引物)进行复查。结果仅10例呈阳性，阳性率为43.5%。然后，应用X区引物的PCR进行复查。与S区引物的结果相比，重复率达90%(9/10)，提示本研究的结果是准确的，而临检中存在污染。
四、HBsAg检出与HBV DNA检出的关系
HBsAg和HBV DNA检出的关系见表1。RIA法阳性者有1例为HBV DNA阴性，而免疫PCR检测HBsAg为阳性者HBV DNA均为阳性。
表1 HBsAg检出与HBV DNA检出的关系表
项 目 HBsAg(RIA) HBsAg(immuno-PCR)
+ - + -
例数 10 13 12 11
HBV DNA(S区引物)阳性 9 1 10 0
HBV DNA(X区引物)阳性 8 1 9 0
五、免疫PCR检出HBsAg与HBV血清标志的关系
免疫PCR检出HBsAg与HBV血清标志的关系见表2。初步随访发现，23例HBsAg(—)/HBV DNA(+)患者中，1例为无HBV感染标志，该患者临床诊断为甲型肝炎，3次复查HBV血清标志均为阴性，2次复查为HBV DNA阴性，提示为P[1] [2] 下一页
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