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丙型肝炎患者外周血单个核细胞对特异性HCV抗原增殖反应 |
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窦骏 刘克洲 陈智 沃建尔 何南祥 徐陈槐
丙型肝炎病毒(HCV)的发病机制和机体对HCV的免疫应答目前尚不十分清楚。为此，我们研究了丙型肝炎(HC)患者外周血单个核细胞(PBMC)对HCV特异性抗原的增殖反应，从细胞免疫的角度分析机体抗HCV免疫功能及其与临床预后的相关性。
材料与方法
一、病例来源
1995年7月～1997年1月浙江医科大学附属一院及浙江省人民医院住院和门诊急、慢性HC患者24例，其中急性3例，慢性21例；男18例，女6例，年龄25岁～65岁。诊断依据1995年第五次全国传染病与寄生虫病学术会议修订的标准。
二、材料
(一) 抗原 HCV CP9、NS4合成肽、C、E1、E2、NS3基因重组抗原分别由本所、北京医科大学、北京中国药品生物制品检定所提供。
(二) 抗体
1. 鼠抗人淋巴细胞单克隆抗体(McAb)抗CD4+、抗CD8+、异硫氰酸(FITC)标记的羊抗鼠IgG，购于武汉生物制品研究所，用于荧光显微镜检测CD4+、CD8+细胞表型。
2. FITC-抗-CD4+、FITC-抗-CD8+鼠抗人McAb，购于北京医科大学McAb研究室，用流式细胞仪(FACS)检验CD4＋、CD8+细胞表型。
三、方法
(一) HCV RNA、抗-HCV检测 按常规逆转录-套式-聚合酶链反应(RT-nested-PCR)和放射免疫方法进行。
(二) PBMC对HCV抗原的增殖反应 常规分离PBMC，调细胞浓度为2×106/ ml，于96孔细胞培养板每孔加入2×105细胞，每一实验组共设5个复孔，其中4个复孔加入同一HCV抗原。对照组不加抗，阳性对照组加PHA，均设3个复孔(不做CD4＋、CD8+细胞表型检测时，实验组仅设3个复孔，其余相同)。温育6天后取加入HCV抗原和未加抗原的细胞各1孔，用荧光显微镜/FACS检测PBMC在抗原刺激前后CD4＋、CD8+细胞表型百分率，余3孔加3H-TdR 0.5μCi/孔，继续培养16～18小时收集细胞，在液闪计数仪上测cpm,以刺激指数(SI)表示PBMC对HCV抗原的增殖反应，并以SI≥2.1为阳性［1］。
(三) 荧光显微镜、FACS检测CD4＋、CD8+细胞表型 按武汉生物制品研究所试剂盒说明书和参考文献［2］方法分别操作。
(四) 统计方法 t检验和F检验。
结果
一、HC患者PBMC对不同剂量合成肽增殖反应
不同剂量合成肽刺激HC患者PBMC的增殖反应不同，随着抗原剂量加大，PBMC的增殖反应愈加明显，但每孔加入8μg或12μg时CP9的SI分别为1.72和1.75；NS4的SI分别为1.68和1.73经t检验，两者差异无显著性(P>0.05)。而正常人PBMC对CP9、NS4抗原的刺激后，均未出现明显增殖反应。
二、HC患者PBMC对不同HCV抗原的增殖反应
见表1。按PBMC出现增殖反应SI≥2.1的比例，在各抗原间依次为26.7%(C)、25%(CP9)、18.2%(E1)、18.2%(E2)、16.7%(NS4)和9.1%(NS3)，其中C区抗原引起PBMC的增殖反应最为明显。2例急性HC患者的PBMC对HCV不同区抗原均出现阳性增殖反应，且血清HCV RNA阴转伴ALT正常。
表1 HC患者PBMC对不同HCV抗原刺激的增殖反应
患者 年龄 性别 ALT 抗-
HCV HCV
RNA 基因
型 PBMC增殖反应(SI)
合成肽 重组抗原 PHA
CP9 NS4 C E1 E2 NS3
1 65 M A + + Ⅱ 1.10 1.05 5.96
2* 37 F N + - Ⅱ 2.27 2.13 7.20
3 28 M A + + Ⅱ 1.46 1.55 6.29
4 48 M N + + Ⅲ 1.81 1.85 12.68
5 54 F A + + Ⅱ 2.79 1.13 12.15
6 28 M A + + Ⅰ/Ⅱ 1.80 2.03 14.00
7 61 M NT + - Ⅱ[1] [2] [3] 下一页
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