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LMP2与LMP7基因多态性与强直性脊柱炎并发虹睫炎易感性关系的研究 |
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1.2 DNA提取
由快提方法获得，取外周静脉血0.5 ml，2%EDTA抗凝，裂解红细胞，白细胞沉淀用500 μl PCRbuffer加蛋白酶K 3 μl(10 g/L)55 ℃水浴1小时，96 ℃10分钟灭活，取10 μl作PCR模板。
1.3 PCR扩增及产物酶切
1.3.1 HLA-B27基因检测：利用Dominguez等〔3〕设计的引物特异扩增HLA-B27外显子3部分序列，产物长度135 bp，引物序列为：上游5′-GGGTCTCACACCCTCCAGAAT-3′，下游为5′-CGGCGGTCCAGGAGCT-3′。50 μl体系含模板10 μl，MgCl2 2.0 mmol/L，Taq酶2 U。PCR条件为(PE 400)97 ℃ 5分钟，97 ℃ 10秒，65 ℃ 1分钟，70 ℃ 30秒，30循环，70 ℃延伸5分钟，2%琼脂糖凝胶100 V电泳，紫外灯下观察。
1.3.2 LMP基因检测：利用Maksymowych等〔4〕设计的引物特异扩增LMP2基因第2外显子140 bp片段，引物为上游5′-GAACTCCAGAGCTTCATA-3′；下游5′-GTGAACCGAGTGTTTGAC-3′。50 μl体系含模板10 μl，MgCl2 2.0 mmol/L，Taq酶2 U，PCR条件为97 ℃预变性5分钟，97 ℃ 10秒，55 ℃ 30秒，72 ℃ 30秒，30循环，72 ℃延伸5分钟。LMP7应用Glenn Y.Deng等〔5〕设计的引物特异扩增LMP7基因含第6内含子在内的774 bp片段，引物为上游5′-TCTACTACGTGGATGAACATGG-3′；下游5′-TTGATTGGCTTCCCGGTACTG-3′，PCR条件为97 ℃预变性5分钟，97 ℃ 10秒，63 ℃ 30秒，72 ℃ 1分钟，30循环，72 ℃延伸5分钟。PCR内参采用β-actin，引物序列根据文献cDNA序列而设计〔6〕。上游5′-ATCATGTTTGAGACCTTC-AACA-3′，下游5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′，产物长度为318 bp。
PCR产物纯化：PCR产物40 μl，3 mol/L NaACO 4 μl，无水乙醇100 μl，－20 ℃沉淀过夜。12 000 r/min离心15分钟。70%乙醇洗两次，晾干。20 μl灭菌水溶解。20 μl酶切体系依次加入：10 μl PCR纯化产物，Buffer 2 μl，BSA 0.2 μl，CfoI 5U，水7 μl。37 ℃水浴过夜，3%琼脂糖100 V电泳。有时LMP2酶切产物用13%PAGE胶电泳。
1.4 LMP基因多态性分析
LMP2基因扩增产物为LMP2基因第二外显子中140 bp片段，等位基因A第98位是A，等位基因B第98位A为G代替，CfoI内切酶识别序列为GCGC，将B等位基因切成98和42两个片段。LMP7B等位基因(于第六内含子)依据同理可被CfoI内切酶可切成两个片段。
1.5 统计学处理
各组患者LMP等位基因多态性的比较采用2×2和2×3 χ2检验。并且计算OR值和95%CI值。
2 结 果
2.1 HLA-B27检测结果：HLA-B27正常人群阳性率为2.2%，AS患者为93.8%，结果与我中心以前调查资料相似〔1〕。AS＋AAU患者阳性率为90.5%，单纯AAU为65.2%。详见表2。
表2 各组人群HLA-B27检测结果
例数 阳性 阴性
正常人 45 1 44
AS 64 60 4
AS＋AAU 21 19 2
AAU 23 15 8
2.2 LMP2基因型频率与发病的关系：正常人群LMP2BB基因型频率为53.3%，AB基因型为42.2%，AA为4.4%，AS患者分别为62.5%、35.4%和1.5%。AS有AAU病史的三者频率分别为85.7%、9.5%和4.8%，单纯AAU频率分别为87.8%、13%和0。AS有AAU病史的患者和单上一页 [1] [2] [3] 下一页
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