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人肝癌细胞系7721丙型肝炎病毒体外感染模型的建立 |
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理想的感染模型。用自然存在于患者血液中的HCV直接感染培养细胞，可建立接近自然感染状态的细胞模型，适宜于HCV感染靶细胞的方式、复制机制以及中和抗体/疫苗的研究。我们用慢性丙型肝炎患者的血清感染体外培养中的人肝癌细胞系7721，不但在细胞及培养上清中检测到HCV正、负链RNA，而且发现HCV抗原能在细胞内有良好的表达，HCV的复制至少可达66天。
材料和方法
一、主要材料
(一) 实验血清 实验所用的感染血清3份均来自重庆地区慢性丙型肝炎患者，经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测证实HCV RNA为阳性。正常血清来自我院输血科健康献血员；细胞培养所用的小牛血清由本校试剂中心提供。血清无菌采集后分装并冻存于-20℃，用前经56℃ 30分钟灭活补体。
(二) 主要试剂 (1)PRMI-1640培养基购自美国GIBCO公司。(2)链霉菌亲生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SP法)免疫组化试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司(产品批号：81215710)。(3)HCV NS3及NS5单克隆抗体；RT-PCR检测HCV正、负链RNA试剂盒由北京医科大学肝病研究所提供［1，2］(产品批号：981102)。(4)Dig标记的HCV正链寡核苷酸探针参照Bukh等［3］的HCV 5′非编码区探针序列，即(-95～-56nt)5′-CTGCTAGCCGAC- TAGTGTTGGGTCCGCGAAACCGCTTGTGG-3′，由军事医学科学院第二研究所制备和纯化。(5)碱性磷酸酶标记的地高辛抗体(工作浓度1∶500)、封闭试剂和NBT/BCIP溶液为德国宝灵曼公司产品。
二、实验方法
(一) HCV体外感染7721 同时设立感染组和对照组。取细胞生长良好的培养瓶/板，移去培养基，加入HCV感染血清(感染组，感染血清终浓度为10%)或等量的正常人血清(正常对照)或等量的生理盐水(空白对照)，加入适量完全培养基(含10%小牛血清)，轻轻摇匀，置入培养箱37℃ 8小时后，弃去上清，以1640充分洗涤4～6次，并留取最后1次洗液以待检，然后再加入培养基继续培养。培养过程中始终保持培养液总体积不变。
(二) 标本的收集 感染后每2～5天从培养瓶中收集部分培养上清、细胞或长有细胞的玻片(细胞爬片)，其方法如下：(1)培养上清：吸取1ml培养上清置经DEPC水处理并高温的Eppendorf管中，1 000g离心5分钟后取上清并移入另一管中(以去掉细胞碎片)，置入-20℃冰箱冻存，备RT-PCR检测。(2)细胞收集：弃去培养上清，1640洗涤4～6次，0.25%胰蛋白酶消化部分细胞制成细胞悬液，以50g离心5分钟，弃上清后，重悬于PBS再离心，如此反复6次(排除培养上清的干扰)，将细胞沉淀于-20℃冰箱冻存，备RT-PCR检测。(3)细胞爬片：用镊子取出细胞爬片，立即用PBS漂洗3次，每次30秒。然后用4%多聚甲醛固定15分钟，再用PBS漂洗3次，置-20℃保存，备免疫组化检测细胞内HCV抗原表达或原位杂交对细胞内的HCV RNA进行定位。
(三) 细胞及培养上清中HCV正、负链RNA的检测 采用RT-PCR法，按说明书进行操作［2］。
(四) 免疫组化检测细胞内的抗原表达 取制备好的细胞爬片，PBS漂洗3次，每次5分钟(下同)；用0.03% H2O2-甲醇溶液37℃温育10分钟，PBS漂洗；移入含0.02% Tween20的PBS 2分钟，20%的正常羊血清37℃温育10分钟，吸去多余的液体；加入HCV NS3或NS5单克隆抗体，4℃冰箱中温育12～24小时；PBS漂洗，加生物素标记的第二抗体，37℃温育30分钟；PBS漂洗，加入SP液，37℃温育30分钟，PBS漂洗；DAB显色3～5分钟，PBS漂洗终止显色，苏木素衬染，透明，封片，显微镜下观察，照相。对照实验：分别用1%小牛血清白蛋白(第一抗体稀释液)、PBS替代第一抗体做第一抗体替代对照；用PBS分别替代生物素标记的第二抗体和SP液作试剂替代对照。
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