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乙型肝炎病毒C基因逆转录病毒载体的构建及在永生化人外周血B细胞中的表达 |
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ATGGACATT-3′；3′端引物为P2：5′-GCGC-
TCGAGCTAACATTGAGATTCCCG-3′，扩增区段位于HBV nt1890～2452，包含HBV/C区，5′端引物含BglⅡ酶切位点，3′端引物含XhoⅠ酶切位点。
三、目的基因的制备
以质粒pCP10(含双拷贝HBV全基因组，ayw亚型)为模板，以引物P1、P2扩增HBV/C区基因，经BglⅡ、XhoⅠ双酶切后，低溶点琼脂糖回收。
四、载体的制备
小量抽提质粒pXT1，经BglⅡ、XhoⅠ双酶切后，低溶点琼脂糖回收。
五、目的基因和载体的连接、转化
目的基因和载体在T4连接酶的作用下，15℃连接过夜。取连接产物2μl转化感受态细菌XL1-blue，在Amp抗性培养板中37℃温育过夜。
六、重组质粒的鉴定
同时采用聚合酶链反应(PCR)和双酶消化2种方法。
七、重组质粒转染永生化人外周血B细胞株
采用脂质体介导方法。收集2×106EB病毒永生化的人外周血B细胞(本室建立，稳定传10代以上)，用不含血清和抗生素的DMEM培养液洗2次，再以0.8ml DMEM培养液混合并重悬细胞。2μg重组质粒和10μl脂质体(Gibco)加入到总体积200μl的不含血清和抗生素的DMEM培养液中混合30分钟。缓慢加入到细胞中，5小时后加4ml完全1640培养液，24小时后更换完全1640培养液，继续培养48小时后1∶15传代，加新霉素400μg/ml筛选，每3.5天换液。
八、重组质粒在宿主细胞中表达的检测
采用流式细胞方法。新霉素筛选6周后，收集2×106筛选阳性的细胞，以PBS洗1次，200μl重悬与兔抗HBcAg抗体(美国Zymed实验室)室温下温育45分钟，洗3次，再以FITC标记的鹅抗兔IgG温育45分钟，流式细胞仪检测分析5 000个细胞。
结果
一、重组质粒pXT1-HBV/C的构建
以引物P1、P2扩增HBV/C区片段，克隆到载体pXT1中，并转染大肠杆菌XL1-blue，在Amp抗性培养板中37℃温育过夜，可见散在的抗性克隆菌落生长。
二、重组质粒pXT1-HBV/C的鉴定
见图2。以重组质粒为模板，以引物P1、P2可扩增出与目的DNA相同大小的片段(Lane4)；重组质粒经BglⅡ、XhoⅠ双酶切后，可得到分别与目的DNA和载体相同大小的2个片段。
1 PCR阴性对照；2 λ DNA HindⅢ/EcoRⅠ;3 PCR阳性对照；
4 重组质粒PCR结果；5 重组质粒BglⅡ、XhoⅠ酶切结果；
6、7 分别为重组质粒BglⅡ或XhoⅠ酶切结果；8 未消化的重组质粒图谱
图2 pXT1-HBV/C重组质粒PCR和酶切鉴定结果
三、重组质粒转染B细胞的筛选
利用脂质体介导重组质粒pXT1-HBV/C转染的B细胞，在新霉素选择培养6天后，对照的B细胞全部死亡；转染的B细胞中也有大量死亡，仅见小量散在的新霉素抗性细胞生长，减半抗生素浓度培养3周后传代扩增，继续培养2周后可用于检测。
四、转染的B细胞目的DNA的检测
常规提取宿主细胞基因组DNA为模板，以引物P1、P2可扩增出与目的DNA相同大小的片段。并同时检测到neo基因。
五、重组质粒pXT1-HBV/C在永生化人外周血B细胞中的表达
流式细胞检测结果见图3。以未转染的永生化B细胞为阴性对照，在检测重组质粒转染的B细胞中，表达HBcAg的细胞占47.4%。
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