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口服丙型肝炎复合多表位DNA减毒鼠伤寒沙门活菌苗的实验研究 |
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5］。本研究把PCX基因克隆到带CMV启动子的真核表达载体pcDNA3后，并把重组质粒转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL3261［6］中，构建HCV减毒口服DNA活菌苗SL3261(pcDNA3/PCX)，免疫小鼠及家兔后，研究该重组DNA活菌苗在体内的免疫应答及其安全性。
材料与方法
一、材料
(一) 质粒与菌株 质粒pUC119/PCX为复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室提供。质粒pcDNA3为第一军医大学钟雄林老师惠赠。减毒鼠伤寒沙门菌LB5000及SL3261为Stanford大学Stocker BAD教授及何笑松博士赠送。
(二) 试剂 HRP-兔抗鼠IgA、小牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司；HRP-羊抗兔IgG、HRP-兔抗鼠IgG购自Calbiochem-Novabiochem International Inc;蛋白质GZ-PCX为我室纯化产品［5］；HCV EIA2 Kit(批号为971009)为华美生物工程公司产品。
(三) 动物 ICR小鼠及新西兰家兔均购自海军医学研究所实验动物中心，健康雌性4周龄小鼠，体重17～20g，每组4只；新西兰家兔体重2～2.5kg，每组3只。
二、方法
(一) 真核表达载体的构建［7］ pUC119/PCX、pcDNA3经HindⅢ/BamHⅠ双酶切后，用胶回收Kit(华舜生物工程公司)分别回收PCX片段及载体大片段，两者在12°C连接过夜，转化TG1，培养过夜后，挑取单菌落接种于2ml LB培养基中，37°C培养10小时，按常规碱变性方法抽提质粒，0.8%琼脂糖凝胶电泳。分别取比对照质粒pcDNA3略大的质粒进行BamHⅠ/HindⅢ双酶切，2%琼脂糖电泳鉴定。
(二) 重组活菌苗的构建 参照文献［8］进行。质粒pcDNA3及pcDNA3/PCX分别先转化到LB5000后，抽提被修饰的质粒后再转化SL3261，获得重组减毒鼠伤寒沙门菌口服活菌苗SL3261(pcDNA3)及SL3261(pcDNA3/PCX)。
(三) 口服免疫 口服免疫方法参照文献［8］进行。免疫剂量小鼠及家兔分别为1×108 cfu/次及2×109cfu/次，隔周相同剂量连续免疫4次，隔2周采集血清1次。
(四) 免疫血清特异性抗体的检测 1.检测抗-GZ-PCX IgG：ELISA方法参照文献［7］，以GZ-PCX包被，二抗为HRP-羊抗免及HRP-兔抗鼠IgG,1∶10 000稀释。2.检测鼠抗-GZ-PCX IgA:ELISA方法同上，以GZ-PCX包被，二抗为HRP-兔抗鼠IgA,以1∶1 000稀释。3.检测鼠sIgG及sIgA：小鼠放净血后，取约10cm小肠及全肺，用0.8ml PBS分别灌洗完全后，离心取上清作为一抗，二抗为HRP-兔抗鼠IgG或IgA,1∶1000稀释。4.兔抗GZ-PCX血清与HCV EIA2 Kit包被抗原反应：分别用免疫血清及空白对照血清(1∶10稀释)与华美HCV EIA2 Kit包被抗原反应，检测免疫血清识别HCV基因表达产物的特异性，二抗为HRP-羊抗人IgG,1∶10000稀释。5.CD4+、CD8+淋巴细胞亚群的检测：自小鼠眼球取血2～3滴，取20μl抗凝血，加入20μl的抗CD4或抗CD8荧光抗体，作用15分钟后加入200μl红细胞裂解液，5分钟后加入1ml PBS,3 000r/min 2分钟，沉淀用400μl PBS重悬后，在Facscalibur流式细胞仪(Becton Dickinson Inc)上检测CD4+及CD8+T细胞数，并计算CD4＋/CD8＋比值。6.迟发性超敏反应(DTH)：用GZ-PCX抗原注射于小鼠后足趾皮下或家兔腿部皮内，注射剂量分别为10、50μg，观察注射部位的变化。7.安全性：免疫各周分别称取各组小鼠平均体重，观察小鼠的存活率及肝脾大小。
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