|
汉滩病毒核衣壳蛋白主要B细胞表位的识别及其基因定位 |
| |
级结构及其基因定位迄今尚未明确。噬菌体表面呈现技术的出现为大量快速地筛检基因-多肽片段文库提供了可能。我们应用单克隆抗体对表达HV汉滩型76/118株S基因随机多肽片段的噬菌体文库进行筛选，并确定了汉滩型病毒(Hantaan virus, HTNV)NP 氨基端的一个主要线性抗原表位。
材料与方法
一、单克隆抗体
抗-HV单克隆抗体L13F3、R31、48A、28B和C321为中国预防医学科学院病毒学研究所出血热室惠赠；3G1和5H5为第四军医大学微生物学教研室制备，H7、F3、B9、B11和H11为南京军区军事医学研究所提供；GDO5为美国陆军传染病研究所Schmaljohn CS博士惠赠。所有单克隆抗体均经盐析初步纯化，以Protein G Sepharose 4FF层析柱(Pharmacia)提取IgG(图1)，并与生物素(ECL Protein biotynylation module, Amersham)交联。
1～5分别为McAb L13F3、C321、R31、48A和28B，6为蛋白相对分子质量标准，从上至下依次为94700，66000，45000，31000，21500和14500，7～15分别为P53蛋白及McAb 5H5、3G1、H7、H11、F3、B11、B9和GD05
图1 纯化的抗-HV McAb的SDS-PAGE
二、丝状噬菌体
可用于表达融合蛋白的丝状噬菌体fuse 5和fuse 2 由美国密苏里大学Smith GP教授领导的实验室构建并惠赠［4］。fuse 5属fd-tet类丝状噬菌体表达载体，结构特点为在其基因Ⅲ区构建了两个单向Sfi Ⅰ克隆位点，便于外源性基因的克隆和表达；该载体的基因Ⅲ功能即感染宿主菌的功能因定向突变产生的读码框发生框移而丧失，但仍可通过其它转化方式导入受体菌并在其中大量扩增；而一旦插入的外源性基因使基因Ⅲ的读框恢复，该类噬菌体便可恢复感染功能；同时该类载体含有四环素(tetracyclin, tet)抗性基因，便于在相应的抗性培养中形成四环素抗性克隆，而且其伴随宿主菌大量增殖时对后者无严重影响。
三、汉滩病毒S基因随机多肽片段噬菌体文库的构建［5］
酶切消化含有HTNV 76-118株S基因的重组质粒pUC18-HTNV-S，回收纯化的S基因；用DNase Ⅰ随机消化并回收50～300bp大小的片段，与克隆接头连接［6］。用Sfi Ⅰ消化提取噬菌体fuse 5的复制型DNA，回收克隆载体，与DNase Ⅰ消化的S基因随机核苷酸片段连接并电击转化MC1061菌，提取表达融合蛋白的噬菌体，测定文库效价。
四、噬菌体表位文库的亲合筛选
(一) Biopanning 以1mg/ml链霉亲合素4℃过夜包被聚苯乙烯平皿，5%BSA室温2小时封闭，0.05% Tween 20-TBS(T-TBS)洗6次，然后加入生物素化的单克隆抗体，室温温育2小时后同上洗3次，加入以0.05%-TBS稀释的表达有融合蛋白的重组噬菌体，4℃过夜温育。次日以0.05%T-TBS洗10次，最后1次浸泡10分钟，分别收集各次洗液。加入0.025mol pH2.2的HCl洗脱液，室温轻轻振摇10分钟，将洗脱回收的噬菌体液转入1.5ml Eppendorf管中，立即加入约1/6体积0.05mmol/L pH9.0 Tris-HCl，经中和后的噬菌体液以Microcon 30(Amicon Inc,USA)浓缩，转染预先饥饿培养的K91/Kan菌，室温20分钟后加入约1ml LB/tet(0.2μg/ml)/Kan(100μg/ml)，37℃40分钟后补加tet至20μg/ml，铺LB/tet平板，37℃过夜培养，次日计数菌落数并收集全部菌落提取噬菌体。根据免疫筛检结果同上进行第2、3次亲合筛选。
(二) 免疫筛检 1. Immunoblot：取部分转化的K91/Kan菌涂布于LB/Tet/Kan抗性平皿，挑取生长的菌落(一般约92个)转种于另一同样的平皿、硝基纤维素膜(覆盖于一LB/Tet/Kan抗性平皿上)及相应的96孔培养板中，过夜培养后将硝基纤维素膜表面生长的菌落洗去，封闭后加入单克隆抗体，并继之与辣根过氧化物酶交联的抗小鼠IgG抗体结合，常规显色并记录结果。实验中常规设置阳性(以McAb GDO5筛选出的阳性重组噬菌体)和阴性(空白噬菌体fuse 2)对照［7］。2. ELISA：用链霉亲合素包被96孔聚苯乙烯微板，加入生物素化的相应单抗，上一页 [1] [2] [3] 下一页
上一个医学论文： 伯氏疏螺旋体外膜蛋白C基因在大肠杆菌中的表达
下一个医学论文： 转化生长因子 1在慢性乙型肝炎患者肝细胞损伤和肝纤维化形成中的意义
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 内科论文 >> 正文