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伯氏疏螺旋体外膜蛋白C基因在大肠杆菌中的表达 |
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BJ-9011为一莱姆病患者血液分离株［4，5］。均由本室保存并在BSK培养基中培养，其基因组DNA制备按常规方法进行。
二、血清标本
莱姆病IgM、IgG抗体阳性血清均来自北京军区某团战士，经临床诊断及IFA检测证实。
三、质粒和菌种
表达质粒LKB2和宿主菌BL21(DE3)由中国预防医学科学院病毒学研究所肝炎室提供。
四、引物和主要试剂
聚合酶链反应(PCR)引物参照文献［6］，PKo株基因序列自行设计，上游引物：5′GCGCCATGAATAATTCAGGGA3′，下游引物：5′TTAAGGTTTTTTTGGAC3′由中国科学院微生物研究所合成。扩增片断为除信号肽外的OspC基因，长度约582bp。限制性内切酶、T4DNA连接酶、Klenow酶等购自Biolab公司，dNTP、Taq DNA聚合酶为Promega公司产品，其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。
五、OspC基因克隆
PCR方法及扩增产物鉴定参照文献［7］进行，扩增产物Klenow酶补平后用DEAE-纤维素膜电泳回收法回收，再经NcoI酶切处理。同时将质粒载体LKB2进行NcoI和SmaI双酶切，回收。T4DNA连接酶连接PCR产物和载体，转化大肠杆菌BL21，经NcoI和ClaI双酶切鉴定阳性克隆。
六、OspC基因在大肠杆菌中的表达及表达蛋白SDS-PAGE分析
将酶切鉴定阳性的重组质粒BT-OspC和BJ-OspC分别转化宿主菌BL21，挑选单斑活化至A600约0.6，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，其诱导浓度为1mM，37℃诱导3小时，收集菌体，离心弃上清，细菌沉淀用12.5%SDS-PAGE电泳检测。并用日本Shimadzu产CS-9301PC型薄层扫描仪分析表达蛋白大小及含量。
七、免疫印迹(Western blot)分析
以空载体的转化菌作对照，用12.5%SDS-PAGE电泳分析两表达质粒，将凝胶分成相同两份，分别进行考马斯亮蓝染色和免疫印迹试验。Western blot方法如下：通过电转仪将凝胶上蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，电转条件为100V，200mA转印1.5小时。以20%小牛血清室温封闭2小时，洗涤，将膜转入1∶100稀释的莱姆病IgM抗体阳性患者血清，37℃反应1小时，洗涤后，将膜转入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgM中，室温反应2小时，以底物4氯-1-萘酚(4CN)和0.01%过氧化氢溶液显色10～20分钟，用去离子水漂洗以终止反应。
结果
一、PCR扩增产物分析及重组质粒的鉴定
通过PCR反应两株螺旋体皆扩增出580bp左右的DNA片段，与预期实验结果一致。重组质粒BT-OspC和BJ-OspC经内切酶NcoI和ClaI酶切，也都能切下一920bp左右的DNA带(载体LKB2中NcoI和ClaI酶切位点之间为335bp)，表明PCR结果及重组质粒酶切分析与设计相符。
二、重组OspC蛋白表达和免疫印迹分析
经挑选的表达质粒BT-OspC和BJ-OspC经常规IPTG诱导表达，发现在诱导3小时时表达量较高，对照蛋白相对分子质量标准，两重组质粒表达蛋白均大于20 000，经薄层扫描仪分析其相对分子质量均为23 000，与实验设计预期结果相符。表达蛋白占总蛋白的34%～50%。免疫印迹试验表明该两重组蛋白皆可与患者血清发生特异性反应(图1，2)。
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