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类风湿关节炎患者Th1 Th2细胞平衡的研究 |
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少。我们利用酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot assay，ELISPOT)在单个细胞水平上检测了RA患者滑液单个核细胞(SFMC)和外周血单个核细胞(PBMC)细胞内细胞因子的表达，比较了RA患者SFMC与自身及正常人PBMC中的Th1/Th2比值，并与患者的Stoke指数作了相关分析。
1 材料与方法
1.1 标本：SFMC及其PBMC取自9例活动期RA病人(见表1)平均受累关节数6.8±29，平均病程(8±6)年，平均红细胞沉降率(67±28) mm/1h，类风湿因子(RF)均为阳性，RA诊断根据1987年美国风湿病学会(ACR)修订标准［2］，滑液均通过穿刺取自病人膝关节［平均白细胞计数(14±8)×109/L］，另取4份健康成人血液标本做对照。
表1 9例RA患者临床资料
病例 病程
年 受累关节数 红细胞沉降率
mm/1h C-反应蛋白
mg/L Stoke指数 滑液白细胞计数
×109/L
1 6 6 85 12.4 10 12.8
2 4 3 49 9.3 6 16.3
3 2 5 65 9.8 9 5.6
4 4 7 30 6.1 7 10.4
5 20 6 41 8.5 3 33.2
6 3 4 47 13.6 5 20.5
7 9 12 79 15.9 12 7.8
8 5 10 105 11.8 14 9.1
9 16 8 93 9.2 12 11.6
1.2 SFMC和PBMC的分离和培养：SFMC和PBMC均按密度梯度离心法分离，以2×106/ml的密度悬浮于含10%胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培养液内，在24孔培养板(NUNC，丹麦)上每孔加1 ml细胞悬液，PMA 10 ng/ml，离子霉素1 μmol/L，莫能菌素3 μmol/L，37 ℃，5%CO2条件下培养6 h。
1.3 细胞内细胞因子染色：采用赵武述［3］的ELISPOT法，收集培养细胞，Hank液洗2次，用离心涂片机甩成细胞涂片，4%多聚甲醛固定30 min，10%正常羊血清封闭10 min，100 μl 0.1%皂素-PBS通透10 min后每张涂片加抗IFN-γ mAb 0.5 μg或抗IL-4 mAb 0.25 μg(阴性对照用PBS代替)，4 ℃反应过夜。PBS冲洗后，每片加生物素标记的羊抗小鼠(二抗)50 μl，室温反应30 min，链霉卵白蛋白碱性磷酸酶复合物50 μl，室温反应30 min，坚固红显色，苏木精复染后甘油明胶封片。
1.4 抗体和试剂：抗人IFN-γ和IL-4单克隆抗体(美国R＆D公司)，生物素链霉卵白蛋白/碱性磷酸酶试剂盒(美国Lab Vision公司)，多聚甲醛、皂素、PMA、离子霉素、莫能菌素均为美国Sigma公司产品，淋巴细胞分离液(d＝1.077，上海第一生化制品厂)，10% FCS，RPMI 1640培养液(美国Gibco公司)。
1.5 统计学处理：结果用±s表示，均数间采用t检验，P＜0.05认为有显著性，Th1/Th2比值与Stoke指数作直线相关分析。
2 结果
2.1 细胞内细胞因子染色的特点：细胞因子(IFN-γ，IL-4)染色阳性的细胞在高倍镜或油镜下核周可见明亮的红色颗粒状斑点，而阴性细胞质无色，每张涂片数1 000个淋巴细胞并计数其中阳性细胞百分率，IFN-γ阳性细胞代表Th1，IL-4阳性细胞代表Th2。
2.2 RA患者滑液和血液中Th1/Th2阳性率及比值：RA患者及正常人的PBMC如不经刺激(PMA＋离子霉素)，涂片上无IFN-γ或IL-4阳性细胞，但在未刺激的RA患者SFMC中有4例检测到IFN-γ阳性细胞(阳性率分别为2%，3%，3%，5%)。经过6 h的刺激培养后，RA患者SFMC中Th1阳性率明显高于BMC〔平均阳性率为(26.2±7.4)% vs(10.2±2.7)%，P＜0.01〕，而Th2阳性率差异并无显著性。与PBMC相比，RA患者S上一页 [1] [2] [3] 下一页
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