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骨关节炎关节软骨及游离体中胶原 型的表达 |
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may play an important role in the pathogenesis of osteoarthritis.
Key words：Cartilage,articular; Collagen; Immunohistochemistry; Joint loose bodies; Osteoarthritis▲
软骨发育的体外研究表明，根据表达的胶原类型不同，软骨细胞的表型主要分为以下三种：①软骨祖细胞(如枝芽或体间充质细胞，合成Ⅰ型胶原)［1］；②分化的透明软骨细胞(如胚胎软骨原基，胎儿骺软骨的静息层，或关节软骨表达Ⅱ、Ⅸ、Ⅺ和Ⅵ型胶原)［2］；③胎儿骺软骨或肋软骨生长层的肥大软骨细胞主要合成Ⅹ型胶原［3］。第四种类似于软骨祖细胞的软骨细胞表型，可通过软骨细胞体外贴壁培养反复传代，及使用5-溴脱氧核糖尿苷(BUdR)，胚胎抽提物，纤连蛋白或视黄酸诱导形成［4］。这种胶原表达类型的调节与反分化相比较，涉及到向成纤维细胞形状转换，形成局部接触的应力纤维，合成Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ型胶原［4］。
目前，有很多文献对这些胶原在体外关节软骨细胞及体内正常胎儿和成人软骨的表达进行了研究［5］。而对退变关节软骨细胞及游离体中的胶原表达研究很少。一些研究表明，在诱导的骨关节炎动物模型［6］和骨关节炎患者［7］中，由于软骨降解刺激胶原合成。新合成的胶原主要是Ⅱ型胶原［6］，以及Ⅸ、Ⅺ和Ⅵ型胶原［8］。其他一些生化研究结果证实，除了纤维软骨，在骨关节炎软骨中未能检测到Ⅰ型胶原［7］。
在本实验中，我们检测了正常及骨关节炎软骨及游离体中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原的表达，观察了软骨表型改变，初步探讨其在骨关节炎发病机制中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料：骨关节炎关节软骨标本共10例，年龄分布为45～65岁，平均年龄58岁，其中男性6例，女性4例。发病部位为膝关节8例，髋关节2例。游离体标本10例，年龄分布为35～46岁，平均为39岁，其中男性7例，女性3例。发病部位均为膝关节。除2例是普通患者外，其余均为职业运动员。
1.2 主要试剂：Ⅰ、Ⅲ型胶原单克隆抗体系本所于长隆研究员在加拿大访问学者时制备，Ⅱ型胶原单克隆抗体购自美国Newmarker公司。二抗及三抗购自美国Jackson实验室；免疫组化常用试剂购自华美公司。
1.3 标本准备及组化染色：取自北京医科大学人民医院关节病诊治中心经关节置换的骨关节炎软骨标本和游离体标本各10例及因交通事故意外致死，无骨关节炎病史正常关节对照标本3例。标本经生理盐水冲洗后，修成约1.5 cm×1 cm×0.2 cm大小，置入4%多聚甲醛溶液中4 ℃固定3 d，再置入15%EDTA溶液中脱钙2个月，脱水，透明，包埋。将5 μm切片进行如下处理：①HE染色，病理组织学检查；②1%甲苯胺蓝染色检查基质中硫酸软骨素含量变化。
1.4 免疫组织化学：①石蜡切片脱蜡至水；②3%过氧化氢室温孵育10 min；③蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min；④0.05%胰蛋白酶37 ℃消化20 min；⑤PBS浸泡3次，每次5 min；⑥10%正常山羊血清封闭，室温孵育10 min；⑦倾去血清，滴加适当比例稀释的一抗，37 ℃孵育60 min；⑧PBS冲洗3次，每次5 min；⑨滴加适当比例稀释的生物素标记二抗 ，37 ℃孵育30 min；⑩PBS冲洗3次，每次5 min；滴加适当比例稀释的辣根酶标记链酶卵白素，37 ℃孵育30 min；PBS冲洗3次，每次5 min；DAB显色，自来水冲洗，复染，封片。
2 结果
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