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雷公藤多甙体外对成骨细胞功能表达的影响 |
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E-MEM培养液、10%小牛血清(NCS)EMEM培养液、磷酸缓冲液(PBS)、0.25%胰蛋白酶溶液、0.1%Ⅱ型胶原蛋白酶溶液、考马斯亮蓝溶液、细胞裂解液、对硝基苯磷酸二钠盐(PNPP)、二乙醇胺溶液(DEA)、碱性磷酸酶底物反应液(PNPP溶液与DEA溶液等体积配制)、牛血清白蛋白(BSA)、对硝基苯酚(PNP)、0.1%茜素红溶液及OB矿化诱导剂A-β液等。
1.4 仪器
超净工作台、冷冻离心机、恒温水浴槽、光学显微镜、倒置相差显微镜、二氧化碳培养箱、可见分光光度计、微量可调式加样器、12及24孔培养板。
1.5 方法
1.5.1 OB分离和培养：参阅文献［3，4］。新生雌性SD大鼠，75%酒精浸泡消毒15 min，去头皮取头盖骨，剔除血管及粘附的结缔组织，PBS清洗3次后剪成小块，用0.25%胰蛋白酶预消化20 min，0.1%Ⅱ型胶原酶消化2次，每次于37 ℃振荡60次/min消化1 h。消化液于1 000 r/min离心10 min，沉淀物即为OB，经PBS洗后，加10% NCS-EMEM培养液吹打，制成细胞悬液，接种培养瓶培养。第2天换液，以后每2 d换液一次。经5～6 d培养。OB生长至汇合，用0.25%胰蛋白酶消化，加10% NCS-EMEM培养液吹打，制成细胞悬液，血球计数板计数后即可作传代培养。
1.5.2 ALP比活性测定［5，6］：OB以3×104个/孔传入24孔板，第2天换液时每孔加入培养液1.9 ml，及不同浓度MT药液100 μl，使MT终浓度为0.01～10 μg/ml，对照组培养液中加入100 μl PBS。每浓度组均设4个复孔。每2 d换一次液，经6 d培养细胞生长至汇合时进行ALP比活性测定。测定时各孔经PBS洗后，加细胞裂解液1.0 ml，使细胞破碎，制成悬液，取50 μl，加入1.0 ml ALP底物反应液，37 ℃恒温水浴10 min，取出，用0.1 mol/L NaOH 1.0 ml终止反应，于723型分光光度计405 nm处测定吸收值。用细胞裂解液50 μl代替细胞悬液作空白调零。样品吸收值在ALP标准曲线上读取酶活性值(U/L)。另取细胞悬液50 μl，加入2.5 ml考马斯亮蓝液混匀，于723型分光光度计595 nm处测定吸收值。同样以细胞裂解液50 μl代替细胞悬液作空白调零。样品吸收值在BSA标准曲线上读取相应浓度(mg/L)。ALP比活性计算：ALP比活性(U/mg)＝ALP活性(U/L)/蛋白浓度(mg/L)。
1.5.3 OB矿化能力测定［7，8］：OB以8×104个/孔传入12孔板，第2天换液时每孔加入含10%矿化诱导剂A-β的NCS-EMEM培养液1.9 ml，及不同浓度MT药液100 μl，使MT终浓度为10－5～10－1μg/ml，对照组培养液中加入100 μl PBS。 每浓度组均设4个复孔。每天观察矿化结节形成情况，每2 d换液一次，经14 d培养矿化结节形成时进行矿化结节的染色计数。染色时将各板孔中培养液吸除，以95%乙醇固定10 min，0.1%茜素红染色0.5 h，吸去染液，水洗后在倒置显微镜(40倍)下计数。茜素红染色阳性结果为红色结节，在倒置镜(去相差)下即可清晰观察。
1.6 统计学处理
所得结果以±s(n＝4)表示，进行两样本均数的t检验，方差不齐时为t检验。药物剂量与效应的相关分析：以OB ALP比活性及矿化结节计数等指标对药物浓度的对数值作药物量效的相关性分析。
2 结果
2.1 MT体外对OB ALP比活性的影响：见表1。
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