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大鼠血管球囊成形术后血管局部纤连蛋白的改变 |
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7、14、30天四组取材，每组8只，4%多聚甲醛原位固定15分钟，取出中间段胸主动脉大约4 cm，再用4%多聚甲醛继续固定2小时，30%蔗糖PBS(pH 7.2)液4℃过夜，DCT包埋，液氮冻存。连续冰冻切片(10 μm)，4%多聚甲醛固定切片5 mm，切片密封于有干燥剂的盒内，-70℃保存备用。
3.探针的制备：PFH1质粒扩增、纯化参照《分子克隆》方法［3］，纯化后的质粒用HindⅢ酶切，得到1 kb左右片段，用地高辛标记试剂盒(Boehringer公司)标记探针。
4.原位杂交：参照苏慧慈［4］的《原位杂交》法，杂交前步骤：冰冻切片从-70℃取出，放至室温，10 μg/ml蛋白酶K 37℃孵育30分钟，用DEPC处理的PBS(pH 7.2)洗10分钟×3次，新配制的0.25%乙酰酐三乙醇胺洗10分钟，2×SSC洗5 min×2次，梯度酒精脱水各2 min，凉干，加预杂交液42 ℃孵育2小时。杂交反应：DNA探针97℃变性15分钟，放置冰上5分钟，按1 μg/ml浓度加入预杂交液配成杂交液，倾去玻片上的预杂交液，加入杂交液，42℃孵育4～6小时。杂交后反应：倾去杂交液，2×SSC洗5分钟×4次，0.1×SSC 42℃洗30分钟×2次，入buf-fer 1室温振摇2分钟，buffer 2室温振摇2分钟，擦去周围缓冲液，加用buffer 2稀释的抗地高辛抗体(1∶500)，室温孵育2小时，入buffer 1室温洗15分钟×2次，buffer 3室温3分钟，擦去周围缓冲液，加(NBT/Bcip)显色，室温显色2～12小时，随时镜下观察，出现紫红或蓝紫色阳性信号。
5.免疫组化：参照ZYMED公司的SPTM试剂盒的Modified SP法：冰冻切片放至室温，3%过氧化氢孵育5分钟，0.05%胰酶37℃孵育10分钟，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，1%正常山羊血清(PBS稀释)室温封闭10分钟，倾去血清，加入1∶200兔抗鼠-抗4℃过夜，PBS冲洗5分钟×3次，滴加生物素标记的二抗(1% BSA-PBS稀释成1∶300)37℃孵育1小时，PBS冲洗5分钟×3次，辣根过氧化物酶标记的链霉卵蛋白素(PBS稀释成1∶300)37℃孵育1小时，PBS冲洗5分钟×3次，，DAB显色，苏木精复染，脱水，树胶封固。
结果
1.原位杂交：正常对照组：中层和外膜均未见Fn表达；术后第3天组：Fn在中层平滑肌细胞开始表达，并主要集中在近管腔的内弹力层附近；第7天组：Fn表达进一步增加，且主要集中在近内膜中层部位；第14天组：有明显新生内膜形成，中层和内膜的Fn mRNA表达强阳性，以新生内膜最为明显；第30天组：新生内膜进一步增厚，mRNA持续表达强阳性；未加探针组：示背影清晰，未见明显非特异着色。
2.免疫组化(附图)：正常组呈阴性反应(G)；第3天组(H)：近内膜部位有一层阳性显色；第7天组(I)：中层平滑肌细胞阳性结果进一步增加；第14天组(J)：有新生内膜形成，且内膜呈强阳性显色；30天组(K)：内膜进一步增厚且持续表达强阳性。
附图 大鼠胸主动脉冰冻切片免疫组化结果(×200)
讨论
目前认为损伤后的过度修复是PTCA术后再狭窄的关键。内膜损伤后，一系列因子异常表达、激活，平滑肌细胞的表型发生改变，从收缩型(成年型)向合成型(胚胎型)转化，平滑肌细胞开始大量增殖、迁移并合成大量的细胞外基质，使内膜增厚、管腔狭窄［5］。在此过程中，细胞外基质起着不容忽视的作用。纤连蛋白是一种重要的细胞外基质，在组织分化、胚胎发育中起重要作用，胚胎时期高表达，成年动物低表达，但损伤后代偿性增加。在成年大鼠血管，Fn无明显表达。当血管内膜损伤后，Fn代偿性合成和分泌，参与再狭窄的过程。本研究发现，损伤后3天中层平滑肌开始表达，第7天进一步增加，且主要集中在近内膜的基底膜部位，与文献报道的平滑肌细胞从第3天到第7天开始大量增殖与迁移相吻合［6，7］，说明Fn表达可能与平滑肌细胞的增殖并由中层向内膜迁移有关。本实验室在体外培养平滑肌细胞实验发现，纤连蛋白能促进平滑肌细胞的增殖与迁移，从另外一个侧面证实这一点。第14天可见明显内膜增生，中层和内膜均有明显Fn表达，以新生内膜为主；30天新生内膜进一步增加，并持续表达强阳上一页 [1] [2] [3] 下一页
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