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肾综合征出血热患者汉坦病毒抗原特异性T细胞克隆的初步研究 |
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陈龙邦 王彦宏
肾综合征出血热(HFRS)患者病程中存在着错综复杂的免疫调节功能异常［1～4］。为了进一步探讨汉坦病毒感染过程中机体免疫调节功能失衡的机制，我们进行了从HFRS患者外周血建立病毒抗原特异性T细胞克隆的初步工作。
材料和方法
一、病毒抗原
以汉坦病毒L99株感染Vero E6细胞，待感染细胞免疫荧光达“++++”时冻融，收集培养上清，经56℃30分钟灭活。正常Vero E6细胞培养上清同法处理作为对照。
二、淋巴细胞
选择5例不同病期(发热期1例、少尿期1例、多尿期2例、恢复期1例)的HFRS住院患者，无菌采静脉抗凝血，常规分离淋巴细胞。
三、实验方法
(一) 抗原增殖试验 将自HFRS患者外周血分离的单个核细胞(PBM)用RPMI-1640培养液(含15%灭活人AB血清)调整为1×106/ml，加于96孔培养板，每孔0.2ml，并加入不同浓度的汉坦病毒抗原，37℃、5% CO2下培养6天。培养结束前12小时，每孔加入3H-TdR 1 μCi。收集细胞测3H-TdR掺入量，按下式计算刺激指数(SI)：
SI=抗原刺激细胞3H-TdR掺入cpm值/对照抗原细胞3H-TdR掺入cpm值。
(二) PBM的活化与T细胞克隆 从1例对L99株抗原增殖反应阳性的HFRS患者(多尿期)采血50ml，Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离PBM，用含10%灭活人AB血清和终浓度1∶30的L99株抗原的RPMI-1640调至2×106/ml，加入96孔圆底板(每孔0.2ml)，37℃、5% CO2条件下培养7天。在第7天时，用密度梯度离心分离母细胞，用有限稀释法进行克隆。每孔种入1个细胞/0.2ml，培养液含终浓度1∶30 L99株抗原及重组人IL-2(Gibco产品)200IU/ml经105及3000 rad照射的自身PBM，置37℃、5% CO2下培养，每3天补充L99株抗原及IL-2，至14日可见克隆生长，再过7天后，将有克隆生长的培养孔细胞转移至48孔培养板，加入饲养细胞、抗原及IL-2进行扩展。
(三) 汉坦病毒抗原特异性T细胞克隆的筛选 克隆细胞以1×104/孔，加入2×105经射线照射的自身PBM、1∶30的L99株抗原或破伤风毒素(T.T，Gibco产品)20μg/ml，37℃、5%CO2下培养3天，培养结束前8小时，每孔加入1 μCi3H-TdR，收集细胞测cpm值，计算SI。
(四) T克隆株表面标志的鉴定 采用间接免疫荧光法［1］。
结 果
一、HFRS患者PBM对汉坦病毒抗原的增殖反应
我们测定了5例HFRS患者外周血PBM对汉坦病毒L99株抗原的增殖反应，结果见表1。可见SI与血清特异性抗体滴度无明显关系。
表1 HFRS患者PBM对汉坦病
毒抗原的增殖反应
例号 病期 抗-HFRS-IgG滴度 SI
例1 多尿期 1∶2048 9.9
例2 发热期 1∶80 2.1
例3 少尿期 1∶1024 1.8
例4 多尿期 1∶5120 2.6
例5 恢复期 1∶5120 3.1
选择SI较高的例1 PBM进行活化与克隆，其淋巴细胞SI从活化前的9.9增加到26.8，CD4/CD8比值从0.8增至1.2。
二、T克隆株对多种抗原的反应
从近400孔稀释孔中得到24株T细胞克隆，其中4株以汉坦病毒抗原特异的方式增殖，见表2。
三、T克隆细胞株的表型
4株汉坦病毒抗原特异性T细胞克隆的细胞表面标志为CD3+、CD4-、CD8+。
表2 T克隆细胞株对多种抗原的增殖反应（cpm,±s）
克隆煮
L99株抗原 Vero E6对照 T.T 1640对照
B2 3334±109 88±10 145±22 102±27
F6 4341±216 161±28 213±16 254±66
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