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bco公司产品)，灭活胎牛血清(北京北郊牛奶厂，北京医科大学监制)，胰蛋白酶，Tween-20，Tris，TNF-α(5×109 U/L，由第四军医大学惠赠)、牛血清白蛋白(BSA)、去污剂相容性蛋白定量试剂盒(Bio-Rad)、ECL Western blot发光试剂和胶片(Amersham公司产品)。
1.2 方法
1.2.1 RA滑膜细胞的体外培养：20例类风湿关节炎病人均符合1987年美国风湿病协会(ARA)诊断标准〔1〕。进行全膝关节置换或膝关节滑膜切除时，无菌获取滑膜组织，尽量剔除脂肪及纤维组织，PBS清选两遍，剪成约1 mm3的碎块，置于无菌瓶内，用0.5 g/L的胶原酶I消化4～5小时，200目纱网过滤后，离心2次，去除脂肪及杂质。加入DMEM培养液(含20%胎牛血清，20 mmol/L HEPES，2 mmol/L L-谷氨酰胺，10万U/L青霉素，100 mg/L链霉素)，分装于培养瓶内，置于37 ℃ 5% CO2孵箱内培养。第2天，滑膜细胞贴壁后，弃除非贴壁细胞，更换培养液，待滑膜细胞基本长满后，0.25%胰蛋白酶＋0.1% EDTA消化传代，实验用3～5代细胞。
1.2.2 滑膜细胞的处理：将3～5代的滑膜细胞消化后，细胞悬液平均置于直径为60 mm的培养皿中，待细胞约90%长满时，吸除培养液，换用5 ml无血清DMEM培养液静息24小时，不同浓度TNF-α刺激滑膜细胞不同时间后，预冷PBS冲洗3遍，加入单去污剂裂解液(50 mmol/L Tris*Cl pH 8.0，150 mmol/L NaCl，0.02%叠氮纳，100 mg/L PMSF，5 mg/L Aprotinin，10 mmol/L矾酸钠，2 mmol/L EDTA，1% Triton X-100)100 μl，置于冰盒上20分钟后，细胞刮仔细收集裂解的细胞，置于0.5 ml的EP管中，涡旋2次，置于冰中静止15分钟，离心15 000 r/min，10分钟，将上清移至新EP管中。
1.2.3 蛋白浓度的测定：参照去污剂蛋白定量试剂盒的说明，首先绘制蛋白定量标准曲线。BSA(牛血清白蛋白)配成原液浓度为45 g/L，用上述单去污剂裂解液依次稀释为0～1.5 g/L的浓度梯度。12.5 μl各浓度梯度标准液及10 μl待测蛋白溶液，依次加入A′液(A液＋S液)62.5 μl，混匀后加入500 μl B液，静止15分钟后，于分光光度计750 nm下测定A值。待测蛋白的浓度通过其A值定出蛋白浓度。
1.2.4 Western blot分析：根据蛋白浓度，每条泳道上样25 μg蛋白，加入等体积的1×SDS凝胶加样缓冲液(50 mmol/L Tris*Cl pH 6.8，100 mmol/L 二硫苏糖醇，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油)，100 ℃加热5分钟使样品中蛋白变性，30%的聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后，将凝胶中蛋白电转移1～1.5小时至硝酸纤维素滤膜上，5%脱脂奶粉封闭4 ℃过夜或室温下2小时，PBS-T(PBS＋0.1% Tween-20)洗膜15分钟×1，室温下于摇床上—抗孵育2～3小时，PBS-T洗膜15分钟×3，二抗孵育1～1.5小时，PBS-T洗膜15分钟×3，于暗室中加入ECL发光试剂约1分钟，X线片曝光，分析结果。
2 结果
2.1 蛋白定量标准曲线见图1。
图1 蛋白定量标准曲线
从图1可以看出A值与蛋白浓度成直线相关，直线方程为Y＝2.77X－0.017，相关系数为0.994。说明该测定方法的可靠性。通过测定待测蛋白的A值，计算出其蛋白浓度。
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