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类风湿关节炎患者T细胞受体BV基因的表达 |
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许多结论甚至相互矛盾〔1〕。为了检测中国人RA患者T细胞是否存在TCR BV基因表达的偏移，我们用半定量RT-PCR方法，分析新鲜分离的未经IL-2刺激的T细胞TCR BV基因的表达。
1 材料与方法
1.1 材料
6例RA患者标本由上海市光华医院提供，RA诊断均符合美国风湿病学会1987年RA修订诊断标准。每例患者行膝关节滑膜切除术或膝关节置换术时同时取关节液，滑膜组织以及外周静脉血。取6名正常人外周静脉血作为对照。
1.2 主要试剂
淋巴细胞分离液(Ficoll)：上海试剂二厂。TRIzol Reagent：Life Technology公司。随机引物：Promega公司。逆转录酶：Life Technology公司。T4多核苷酸激酶(T4PNK)：Promega公司。〔γ-32P〕ATP：北京亚辉公司。TaqDNA聚合酶：Promega公司。dNTPs：Pharmacica公司。PCR引物：中科院上海细胞所。PCR荧光标记引物：北京赛百盛生物工程公司。
1.3 方法
1.3.1 单个核细胞的分离：用Ficoll密度梯度离心法分离外周血(肝素抗凝)中单个核细胞(PBMC)。患者关节液用无血清RPMI 1640作5～10倍稀释，1 000 r/min离心10分钟，沉淀以适量RPMI 1640重悬，Ficoll密度梯度离心法分离关节液中单个核细胞(SFMC)。患者关节滑膜组织于含20%人AB血清、105U/L青链霉素的RPMI 1640中剪碎，加入0.5 g/L胶原酶Ⅳ、0.1 g/L透明质酸酶。37 ℃ CO2孵育2小时。尼龙网过滤，滤液以RPMI 1640作2～5倍稀释，1 000 r/min离心10分钟离心收集细胞，沉淀以适量RPMI 1640重悬，Ficoll密度梯度离心法分离得到关节滑膜单个核细胞(SMMC)。
1.3.2 细胞总RNA提取和第一链cDNA合成：按照TRIzol Reagent试剂说明书操作获取细胞总RNA。按照逆转录酶试剂说明书操作合成第一链cDNA，反应总体积30 μl：RNA 11 μl，加入随机引物(0.5 g/L)1.5 μl，65 ℃变性5分钟，冰浴，加RNasin(8×107U/L)0.5 μl，5×RTBuffer 6 μl，1 g/L BSA 3 μl，100 mmol/L DTT 1 μl，2.5 mmol/L dNTP 6 μl，200 U逆转录酶，37 ℃ 2小时，95 ℃ 5分钟终止反应。
1.3.3 引物5′末端标记：对3′BC和3′AC引物的5′末端进行32P标记：30 μmol/L 3′BC或3′AC引物26 μl，104 Ci/L〔γ-32P〕ATP 5 μl，T 4 PNK Buffer 4 μl，107 U/L T4PNK 2 μl，37 ℃ 2小时，70 ℃延长10分钟，终止反应。
1.3.4 PCR扩增TCR BV基因：PCR反应总体积50 μl：10×PCR Buffer 5 μl，25 mmol/L MgCl2 3 μl，2.5 mmol/L dNTPs 4 μl，15 pmol 5′BV(N)和5′AC引物，15 pmol γ-32P标记或荧光标记的3′AC和BC引物，cDNA 1 μl，Taq酶2 U。反应参数：94 ℃ 45秒，55 ℃ 60秒，72 ℃ 65秒，最后一个循环中，72 ℃延长10分钟。共28～35个循环不等。
1.3.5 PCR扩增产物的定量：20 μl PCR产物上样于5%聚丙烯酰胺凝胶，200 V电泳2～3 h，80 ℃真空抽干2小时，室温或－70 ℃ 压片曝光2～4 h。按X片上条带位置割下相应部位凝胶，测每分钟计数。BV百分比计算公式为：BV(n)＝〔BV(n)/AC(n)/Σ(BV/AC)〕×100%。
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