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单相酶扩散法测定SLE患者血清DNA酶的浓度

se):Sigma公司产品,用去离子水配制成1 g/L,90℃水浴30分钟,-20 ℃保存:溴化乙啶(ethidium bromide,EB):华美生物工程公司产品,用去离子水配成10 g/L的储存液,置棕色瓶中,4 ℃保存;琼脂糖:天象人公司产品,超纯,电泳级。
1.1.2 仪器:紫外透射仪:WP—1型,永嘉上塘教学仪器厂;荧光分光光度计,F—2000型,日本Hitachi公司产品。
1.1.3 检测对象:SLE患者63例,男6例,女57例,全部为我科1997年9月—1998年3月的住院及门诊病人。取外周静脉血3 ml,分离血清。所有患者均符合美国风湿病协会1982年修订的诊断标准。患者按临床症状及实验室检查评定病情活动积分,评定指标参照文献〔4〕,其中活动期患者35例,缓解期患者28例。
1.1.4 正常对照组血清:为我市中心血站的健康献血员38例,性别及年龄均与患者组相匹配。
1.2 实验方法
1.2.1 DNase的测定(单相酶扩散法):实验原理为:当EB与DNA结合后可形成一种荧光络合物,在紫外光照射下发出较强的荧光,而当双链DNA被水解成有5′磷酸和3′羟基末端的寡核苷酸时,EB则不能与之结合而发荧光。在含有EB与DNA的琼脂板上打孔加样,孔中的DNase向周围扩散,水解琼脂板中的DNA形成水解环,在紫外透射仪下可见为不发荧光的暗环。在一定条件下水解环的大小与DNase的浓度成正比。实验步骤如下:①A液:牛胸腺DNA(6 g/L)1 000 μl;EB(10 g/L)50 μl;pH 7.2,0.05 mol Tris-HCl缓冲液(含0.05 mol MgCl2)8 910 μl;1 mol CaCl2 40 μl。②B液:2%的琼脂糖10 ml,用去离子水配制,加热100 ℃,溶解。③将A、B液混匀,灌注琼脂板,冷至凝固,用直径为1.5 mm的打孔器打孔。④取4 μl样本(标准DNase或待检血清)加入琼脂板孔中。⑤37 ℃湿盒孵育16小时。⑥将琼脂板浸泡于0.1 mol的EDTA中,终止反应。⑦于紫外透射仪下观察并测量DNA水解环的大小。若酶浓度很低,可延长孵育时间至48小时。
1.2.2 血清DNA含量的测定:取血清0.1 ml,加pH 7.2,0.2 mol Tris-HCl缓冲液0.7 ml,加RNase(1 g/L)0.2 ml,37 ℃水浴30分钟,取出后加EB工作液(20 mg/L)1 ml,用荧光分光光度计测定荧光强度。每次测定时均用1、5、10、15、20 mg/L的标准牛胸腺DNA绘制标准曲线,从标准曲线可查得被检样品中DNA的含量。

2 结果
2.1 DNase测定的标准曲线的绘制
  用Tris-HCl缓冲液将1 g/L的牛胰DNase分别稀释成10、20、30、40、50、60 mg/L,在最佳实验条件下(见下述),用单相酶扩散法进行检测,于紫外透射仪下观察并测量DNA水解环的大小(图1)。以DNase的浓度为横坐标,DNA水解环直径为纵坐标,绘制标准曲线(图2)。



1~6∶DNase标准浓度:60、50、40、30、20、10 μg/L
图1 DNase的浓度测定(单相酶扩散法)



图2 DNase的浓度测定的标准曲线

2.2 单相酶扩散法检测DNase的影响因素
2.2.1 DNA与EB的浓度:制备琼脂板时,调节DNA和EB的浓度,使DNA的终含量分别为3、4、5、6、7、8 mg,使EB的终含量分别为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg,将不同浓度的DNA与EB进行方阵滴定,检测上述牛胰DNase标准品,发现当DNA浓度过高时,检测的灵敏度下降,低浓度的DNase测不出DNA水解环;而当DNA浓度过低时,则整块琼脂板的荧光亮度较低,与DNA水解环的反差不够明显。EB浓度的过高和过低均可使检测的灵敏度降低,反差减弱。经过方阵滴定,我们摸索出DNA和EB的最佳含量为6 mg和0.5 mg,即在琼脂中的浓度为30%和2.5%。

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