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在大鼠关节滑膜细胞表达人白细胞介素10的基因转移系统的建立 |
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transferred into RSC and be expressed stably.
【Key words】 Gene transfer Retroviral vector Human interleukin 10 gene Rat synoviocytes
类风湿关节炎是一系统性自身免疫性疾病，以侵袭性滑膜炎侵蚀软骨基质和软骨下骨为特征的慢性炎症。滑膜的炎症、渗出、软骨的纤维化变性是导致类风湿关节炎患者关节肿胀、僵硬、变形的主要过程。众多细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-alpha，TNF-α)，白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)在这一炎症损伤中扮演重要角色，抑制TNF-α和IL-1β的产生能缓解关节的侵袭性滑膜炎，改善类风湿关节炎的症状〔1〕。而白细胞介素10是T辅助细胞产生的以抑制Th1细胞克隆的细胞因子合成为特点的多效免疫调节因子，具有重要的抗炎及免疫抑制作用〔2～4〕，本实验旨在建立在大鼠关节滑膜细胞表达人白细胞介素10(human interleukin 10，hIL-10)的重组逆转录病毒载体基因转移系统，为研究通过hIL-10基因转移治疗免疫性疾病的关节损害提供物质保证。
1 资料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒，菌株和细胞，大鼠：表达人白细胞介素-10的逆转录病毒重组体pLX(hIL-10)SN由本室构建〔5〕；空白载体pLXSN，PA317，NIH3T3：军事医学科学院；Wistar大鼠：中山医科大学实验动物中心。
1.1.2 主要酶和试剂：RT-PCRkit：Promega；PCRkit：华美公司；DOTAP：Boehringer Marmn-nheim；G418，DMEM/F12：GIBCO；新生牛血清：杭州四季青生物工程材料研究所；hIL-10 ELISA kit：深圳晶美公司。
1.2 方法
1.2.1 重组逆转录病毒的包装和重组病毒感染滴度测定
将重组质粒pLX(hIL-10)SN和空白质粒pLXSN用DOTAP法导入逆转录病毒包装细胞PA317，培养72小时后，换含400 mg/L G418的10%新生牛血清进行筛选；待抗G418抗性克隆形成后冻存于液氮中备用。将抗性克隆从液氮取出复苏，待细胞达70%～80%左右汇合时，收集其上清液，以102～104的倍数作系列稀释后，分别感染NIH3T3细胞(感染液中加Polybrene 4 mg/L)，感染3小时后换液，继续培养72小时后用含800 mg/L G418的培养基培养14天。以抗性克隆上清液的稀释倍数乘以存活的抗G418的细胞克隆数为重组病毒感染滴度。单位为集落形成单位/L(CFU/L)。
1.2.2 大鼠关节滑膜细胞的转染
按文献〔6〕的方法培养Wistar大鼠关节滑膜细胞。待细胞达60%～80%左右汇合时，分别加入上述抗G418抗性克隆pLX(hIL-10)SN和pLXSN上清(感染液中加Polybrene 4 mg/L)，3小时后换为10%新生牛血清DMEM/F12进行培养；72小时时换为含800 mg/L G418的选择性培养基培养；3天后取细胞分别提取DNA和RNA。
1.2.3 目的基因hIL-10在大鼠关节滑膜细胞表达的检测
1.2.3.1 目的基因hIL-10转移至大鼠关节滑膜细胞的检测：PCR法：取上述转染的大鼠关节滑膜细胞，PBS离心洗涤3次，按文献〔7〕的方法提取DNA，按PCRKit提供的方法作PCR，以一对引物，引物A(pLXSN 1 511～1 530 bp 5′-GTCAAGCCCTTTGTACACCC-3′)，引物C(hIL-10 cDNA 546～525 bp 5′-CCTGATGTCTCAGTTTCGTATC-3′)检测目的基因在大鼠关节滑膜细胞的整合。PCR：Denaturation 93 ℃×1 min，Annealing 50 ℃×1 min，Extension 72 ℃×2 min，35 cycles,Final extension 72 ℃×5 min。
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