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A组链球菌壁多糖的抗原性及交叉反应性研究 |
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，A组链球菌胞壁多糖(PS)与牛心瓣膜糖蛋白之间存在交叉反应性〔3〕，且在风湿热和风心病患者血清中测得抗多糖抗体(ASP)〔4〕，因此人们对PS在风湿热和风心病的发病机制中的作用产生了兴趣。本研究设计了新的抗原提取和纯化技术，提取出PS最具抗原性的部分，以进一步探讨PS在瓣膜病中的意义，并为今后临床测定ASP提供更纯化的抗原。
1 材料与方法
1.1 PS的提取及生化分析
1.1.1 链球菌胞壁的提取〔5〕：本室储存的A组β溶血性链球菌菌种，从风湿热患者咽喉部分离，为成链状排列的革兰阳性球菌，过氧化氢酶反应(－)，A组凝集试验呈阳性反应(Oxoid诊断试剂)，对杆菌肽敏感。链球菌的解冻复苏，纯培养和增菌培养，收集细菌。超声破碎细菌，加胰蛋白酶和链霉蛋白酶各70 mg/L消化细菌蛋白质，并加入氯仿10 ml/L和甲苯30 ml/L，室温放置16小时，27 000×g离心30分钟，可看到四层：①轻微混浊的上清液；②氯仿-甲苯层；③灰黑色界面；④白色沉淀。留下白色沉淀即为细胞壁，加生理盐水洗涤。
1.1.2 PS的提取〔6〕：细胞壁溶液中加入亚硝酸钠和冰醋酸提取出多糖液，加入丙酮结晶析出PS。蒸馏水中透析三次。
1.1.3 PS的进一步纯化和生化分析：采用分子筛凝胶层析法，取葡聚糖凝胶G-100，溶胀，装柱，加样(包括标准分子量的多糖和上述提取的PS)，洗脱和收集(流速0.15 ml/min)，苯酚-硫酸法测定每管收集液中多糖的含量，并以分光光度计测出每管的吸光度(A)值，得出峰值管和相应的洗脱体积(Ve)。
1.2 PS最具抗原性部分的测定
采用双向琼脂免疫扩散法，上述分子筛凝胶层析法得出不同峰值管的PS置于琼脂板中央孔，周边6孔分置6份风湿性心瓣膜炎患者血清(6例患者均为过去确诊为风湿性心瓣膜病，男1例，女5例。本次就诊时为风湿热再发，临床上有发热、关节痛、心功能不全加重等表现，体检时并发现有新的瓣膜杂音或原有杂音性质的改变，和/或超声心动图明显的瓣膜炎征象，实验室指标异常，如：ESR、CRP、ASO增高等)。观察抗原抗体反应产生的白色沉淀线，判断出PS最具抗原性的部分，并收集之。
1.3 牛心瓣膜结构性糖蛋白(VSGP)的提取〔3〕
取牛心瓣膜组织切碎、匀浆加三氯醋酸和尿素提取出VSGP，透析。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定VSGP的含量和纯度。
1.4 PS和VSGP的免疫反应及吸附试验
采用双向琼脂免疫扩散法。
已纯化的PS最具抗原性部分和VSGP分置琼脂板中央孔，周边6孔分置6份不同风湿性心瓣膜炎患者血清，观察沉淀线。然后用VSGP吸附患者血清中的抗体，并以生理盐水对照。被吸附后的血清再与PS反应，以观察PS和VSGP是否存在交叉反应性。
2 结果
2.1 PS的组成部分：根据每个洗脱管测得的吸光度(A)值和相应的洗脱体积(Ve)，绘制出PS的洗脱曲线。根据标准曲线，PS的4个洗脱峰的分子量见表1。
表1 四个部分多糖的分子量
PS部分 洗脱体积
ml logM 分子量
PS1 57.5 2.181 150 000
PS2 70.5 1.819 66 000
PS3 79.5 1.570 37 000
PS4 94.5 1.175 15 000
由表1可见，PS的分子量为15 000～150 000。
2.2 PS最具抗原性部分的测定：只有PS3(分子量37 000)可与患者血清抗体有反应(观察到白色沉淀线)。而其他三个部分均无沉淀线，可见PS3(37 000)最具抗原性。
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