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甲状腺癌中甲状腺特异性转录因子 |
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林玲 大野诚 远藤登代志 女屋敏正
甲状腺特异性转录因子(TTF-1)表达于甲状腺滤泡细胞，对于甲状腺球蛋白(TG)，甲状腺过氧化物酶(TPO)及促甲状腺激素受体(TSHR)基因表达具有重要调控作用〔1〕。远藤氏已从大鼠肝脏基因组文库中克隆出TTF-1并鉴定了其结构特征〔2〕。另一方面，良、恶性甲状腺肿瘤组织中，TTF-1表达量不同；而且TTF-1的 表达量与 TG、TPO及TSHR
mRNA表达量呈一定相关性〔3〕。大野氏的研究发现甲状腺癌组织中TSHR基因发生突变，我们推测TTF-1也可能存在突变，从而导致甲状腺特异性基因表达异常。本文应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)寻找TTF-1 cDNA突变。
一、材料和方法
1.模板准备：手术时取甲状腺乳头状癌28例，滤泡癌4例；8例甲状腺癌旁组织作为对照组。所有患者均无甲亢或甲减表现。液氮迅速冷冻标本并贮存于-80℃，用酸胍-酚-氯仿(AGPC)法从0.5克组织中提取总RNA。20μl反转录体积中用11单位鸟反转录酶将mRNA反转录成cDNA。
2.引物准备：根据Ikeda等〔4〕发表的TTF-1基因序列设计特异性引物。引物序列、核苷酸位置及扩增片段长度如下：
表1 引物序列
引物 碱基序列 核苷酸位置
B 5 -AACGGCAACCTGGGCAACAT_3 262～515
5 _TGCGCCTGCGAGAAGAGCAC_3 < 440～803
3.PCR-SSCP分析：PCR操作按Saiki等报道的方法，在50μl反应体积中含有：100ng 的模板 cDNA，1.5单位Taq DNA多聚酶，125ng32磷标记的顺义引物，125ng反义引物，1.25mmol/L各种三磷酸脱氧核苷酸，10mmol/L Tris盐酸(pH 8.3)，1.5mmol/L氯化镁，50mmol/L氯化钾及0.1g/L明胶。PCR在DNA扩增仪(2400型，美国Perkin Elmer公司)上进行。循环参数：94℃，30秒→55℃或60℃，1分钟→72℃，2分，循环35次。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测特异性电泳带。
根据Orita报道的方法进行SSCP分析：2μl PCR扩增产物与8μl反应终止液(95%去离子甲酰胺，20mmol/L乙二胺四乙酸，0.05%溴酚蓝及0.05%二甲苯青)相混。95℃变性3分钟，混合液(1μl/行)加样于6%聚丙烯胺凝胶电泳(90mmol/L Tris硼酸盐，pH 8.3,4mmol/L EDTA及体积分数为10%甘油)，室温中40W电泳2小时。电泳期间凝胶前后面分别置一电风扇冷却散热。电泳完毕后冰醋酸固定、干燥后，用BAS 2000扫描。
二、结果
1.应用RT-PCR法，从所有甲状腺癌组织及甲状腺癌旁组织扩增出TTF-1 cDNA片段B及C，特异性电泳带出现在所预料的位置(253bp及363bp，见图1)。
图1 甲状腺癌标本TTF-1 cDNA片段B(A)及片段C(B)PCR扩增后2%琼脂糖凝胶电泳
(A)及(B)1：分子量标记(Φ×174-HaeⅡ)，由上至下依次为1353，1078，872，603，310，281bp. (A)及(B)2～4：依次为甲状腺癌旁组织，滤泡癌及乳头状癌
2.SSCP时，所检测的32例甲状腺癌组织及8例癌旁组织片段B均未显示电泳迁移率改变，而2例乳头状癌则在片段C出现电泳迁移率改变(见图2的第10、11行)。
图2 甲状腺癌中TTF-1 cDNA突变的SSCP分析
1～3：甲状腺癌旁组织，4、5：滤泡癌，6～15：乳头状癌。10、11：异常电泳带
三、讨论
已知TG，TPO及TSHR的组织特异性的表达的调控是一种转录水平的调控〔5〕。TTF-1是一种表达于甲状腺滤泡细胞的38 000的转录因子，具有二个基本的分子功能：1.DNA结合功能；2.转录活化功能，能够识别TG、TPO、TSHR启动子〔6〕。启动子突变效应研究发现：结合部位DNA序列变化可剥夺TTF-1的结合功能及启动子活性。转基因细胞模型研究提示TTF-1对于分化的细胞表型的表达起着重要作用：转染Kirst[1] [2] 下一页
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