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表达人自身抗原SSB La重组体的构建及其鉴定 |
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采取逆转录－PCR这一简捷有效 途径代替以往用自身抗体或合成寡核苷酸探针筛选cDNA文章的较繁琐的经典基因克隆。
设计引物时采用计算机软件进行辅助分析，选择了SSB/La cDNA中没有的，而表达载体PGEX -2T内有的单个酶切位点EcoRI和BamHI，利用双酶切位点将SSB/La cDNA定向插入PGEA-2T ，避免了DNA插入的反向或串联、自联等问题。
产生的PGEX-2T-La重组体经双酶切鉴定和PCR法来鉴定重组体的正确性。经测序鉴定，本 研究获得的克隆中含有SSB/La基因的真实拷贝。我们所获得的克隆序列与国外研究结果的差 异可能是由于cDNA文库来源的不同，由于同一基因在不同细胞的不同表达，也可能是由于反 转录酶作用的差异。
选用PGEX-2T作为表达载体，其优点是：将目的基因与PGEX-2T定向克隆并导入大肠杆菌表 达，可产生GST和La的融合蛋白，分离纯化简便，可用谷胱甘肽亲合层析柱分离融合蛋白； 而在GST和La之间有凝血酶酶切位点，在体外可切除GST而得到La抗原，可用于抗原表位研究 ，消除GST对La抗原性检测的干扰。而细菌蛋白酶对重组抗原降解减少，因而表达产量较高 。
重组SSB/La抗原能特异识别自身免疫病患者抗血清，因而可用重组抗原作检测以辅助诊断， 也可分析其片断的抗原性以了解其抗原表位［8，9］。下一步，我们将对构建的重组 体诱导表达蛋白，并对其理化性质和生物学活性进行鉴定。我们希望通过对SSB/La重组抗原 的精确定位分析，从分子免疫学角度为某些自身免疫病的诊断和鉴别诊断提供依据，为制备 重组抗原用于临床检测奠定基础。
注释：本课题为上海市启明星基金资助项目(94QB14002)
作者单位：200003 上海，第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心
参考文献
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