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T细胞白血病病毒I型相关的病毒抗原在Graves病中表达的研究 |
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张强 宋作徐荣臻
Graves 病(GD)的病因及发病机理至今未明。单卵双生者相继得本病的共显率只有30%～60%，提示除遗传因素外，环境因素也起作用。已发现微生物感染作为自身免疫性甲状腺疾病的致病因素〔1〕。近年国外研究显示逆转录病毒与GD有联系〔2〕，本研究通过分离GD患者及健康人的外周血单个核细胞(PBMNCs)，采用直接免疫金银染色法(direct immuno gold silver staining, D-IGSS)，从新鲜标本和体外培养两方面测定人类T细胞白血病病毒I型(HTLV-I，又称人类亲T淋巴细胞病毒I型)相关的逆转录病毒抗原，同步测定逆转录酶活性，就逆转录病毒与GD的关联性进行探讨。
一、对象与方法
1.研究对象及试剂：(1)病人组：GD患者54人，均为本院内分泌专科门诊或住院病人，男18例，女36例，年龄(32.4±10.1)岁(10～50岁)；对照组：健康助血员20例，男7例，女13例，年龄(34.8±9.5)岁(18～47岁)，结节性甲状腺肿患者20例，男6例，女14例，年龄(33.2±10.1)岁(16～48岁)，标本为外周静脉血5ml。(2)HTLV-I抗血清：系日本成人T细胞白血病病人抗体阳性抗血清，效价1:1 280，由日本九州大学医学部提供。
2.方法：(1)免疫金探针的制备：首先制备直径为10nm胶体金颗粒，然后按Horisherger等人方法〔3〕将纯化的HTLV-I抗体标记到胶体金颗粒上，再进行纯化，制备特异性的免疫金探针，效价1:40。(2)细胞分离与培养：用Ficoll-hypaque 密度梯度分离液无菌分离单个核细胞，分两部分：一部分测定新鲜细胞中HTLV-I相关抗原和逆转录酶活性，另一部分用RPMI-1640(Sigma公司)不完全培养液洗涤两次，用含20%小牛血清(BSA)RPMI-1640完全培养液将细胞浓度调至1-2×106/ml，加适量PHA及IL-2，置培养瓶37℃密闭培养48小时，然后离心取细胞测HTLV-1相关抗原及逆转录酶(RT)活性。(3)HTLV-I相关逆转录病毒抗原测定：采用直接免疫金银染色法：细胞涂片干燥后用1%戊二醛固定5分钟，流水冲洗后用1%牛血清白蛋白封闭10分钟，磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 7.6，含Tween-20)冲洗5分钟，室温干燥后加入稀释液(含1% BSA，0.5% Tween-20的PBS)稀释的免疫金探针(效价1:20)，置37℃孵育2小时，然后PBS冲洗3次，每10分钟左右，用双蒸水冲洗，甲基绿复染，在光镜下检查反应结果。反应标准：阴性，细胞无黑褐色颗粒；阳性，细胞周围呈黑褐色环(多数由颗粒状或块状褐色银颗粒组成)，有时整个细胞呈黑褐色。(4)逆转录酶活性测定，将1×107细胞用玻璃匀浆器研磨，其匀浆离心(12 000g)20分钟，取上清液加入PEG-6000至终浓度10%，4℃冰箱过夜，离心取沉淀物，然后加入适量反应缓冲液，反应缓冲液中包括0.02mmol/L BrdUTP，10μg/ml Poly A，10mmol/L DTT，0.05% TritonX-100等，取上述反应混合物100μl加入40孔微量反应板，反应板上已交联Oligo T 12-18，然后按Urabe〔4〕和Postmann等〔5〕人方法用BrdU多克隆抗体测定聚合的BrdU(OD=490nm)。
二、结果
54例GD患者中，有36例有不同程度的HTLV-I相关抗原的表达，其阳性检出率为66.7%，培养前(新鲜标本)抗原阴性的标本经培养后仍然阴性；培养前阳性的标本培养后仍然阳性，但经培养后，阳性细胞所占的平均百分数明显增高，从培养前的12%提高到25%。20例健康对照组不表达HTLV-I相关抗原，20例结节性甲状腺肿患者标本也均为阴性。GD组与对照组存在显著差异(χ2=25.96,P＜0.001)。
为进一步明确HTLV-I相关抗原与逆转录病毒的关系，对19例GD患者的标本进行逆转录酶(RT)活性分析，结果HTLV-I相关抗原阳性的标本同时表达RT活性，且其活性随着抗原表达的增加而增高，两者呈正相关，r=0.98(Spearman法)，P＜0.01。
三、讨论
Yamaguchi等〔6〕调查93例HTLV-I抗体阳性的眼葡萄膜炎患者，其中16例有GD病史，而另外222例HTLV-I抗体阴性的眼葡萄膜炎患者均无GD病史。Nakao等〔7〕报道76例原因未明的眼葡萄膜炎患者中，6例[1] [2] 下一页
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