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系统性红斑狼疮凋亡相关基因Fas sFasmRNA表达研究 |
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3］，但这种突变在典型的SLE病人很少发生。
有报道体外观察发现SLE外周血单个核细胞凋亡速度增加［4］，并从蛋白质水平检测发现SLE Fas、sFas表达有异常，但结果很不统一，因此我们采用具有高度敏感和特异性的荧光标记RT-PCR方法对SLE患者外周血凋亡相关基因Fas和sFas mRNA表达进行了检测。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
凝胶摄像仪(UVP)、DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer)、373 Sequencer (ABI)、全血总RNA抽提试剂盒(Qiagen)、Superscript IITM逆转录酶试剂盒(Gibco)、耐热DNA聚合酶试剂盒(Promega)、50% Long Ranger胶(FMC)、ROX标记的DNA Marker:Genescan-500 Marker (Perkin Elmer)。
1.2 检测对象
50例SLE和24例RA患者均来自上海仁济医院风湿专科门诊和病房。SLE诊断全部符合美国1982年ARA标准。其中男5例，女45例，平均年龄(32±11)岁，平均病程(4±3)年；RA诊断均符合美国1987年RA诊断标准，其中男4例，女20例，平均年龄(47±11)岁，平均病程(4.2±2.8)年；正常人为仁济医院职工，男3名，女21名，平均年龄(29±7)岁。
1.3 白细胞分离、总RNA抽提与逆转录
取2 ml抗凝全血，用Qiagen公司的全血总RNA抽提试剂盒抽提总RNA，最后40 μl无RNase的水洗脱。然后以Superscript IITM逆转录酶试剂盒(Gibco)逆转录成cDNA(操作按说明)。
1.4 荧光标记半定量引物的设计与合成
检索EMBL基因数据库，分别设计扩增Fas(同时扩增sFas)和内参β-actin引物。Fas(sFas)负链引物5′端标记一个荧光小分子6-FAM(蓝色荧光)，β-actin负链引物5′端标记一个HEX分子(绿色荧光)。全部引物由中科院上海生物工程制品中心合成。引物序列如下：Fas正链引物：5′-CCAAATGCAGAAGATGTAGATTGTGTG-3′，Fas负链引物：5′-6-FAM-TGCCACTGTTTCAGGATTTAAG-GTTG-3′，扩增Fas长度368 bp，同时扩增sFas长度为305 bp；β-actin正链引物：5′-AGCGGGAAATCG-TGCGTGAC-3′，β-actin负链引物：5′-HEX-ACT-CCTGCTTGCTGATCCACATC-3′，扩增长度：471 bp。
1.5 PCR条件的优化选择
对分别扩增与共同扩增的影响，循环数及模板浓度等对PCR扩增的影响因素进行了探索和优化。
1.6 Fas(sFas)/β-actin PCR扩增
去离子水14.7 μl，10×buffer 2.5μl，25 mmol MgCl2 2.0 μl，10 mmol dNTP 0.5 μl，Fas正链引物0.75 μl(10 μmol/L)，Fas负链引物0.75 μl(10 μmol/L)，β-actin正链引物0.75 μl(10 μmol/L)，β-actin负链引物0.75 μl(10 μmol/L)。将上述各成分按多管的量计算混装，然后每管分装22.7 μl入薄壁Eppendort管，再分别加入2 μl cDNA，振荡混匀后加入石蜡油30 μl覆盖。95 ℃孵育2 min后加入0.3 μl耐 热DNA聚合酶：94 ℃×40 s，60 ℃×40 s，72 ℃×1 min，共26个循环，最后一个循环延伸7 min，然后4 ℃避光保存。
1.7 PCR产物的ABI 373荧光检测
1.7.1 配胶：6% Long Ranger胶配方如下：50% Long Ranger胶3.6 ml、10×TBE 3 ml、10%过硫酸胺(新配制)150 μl、加去离子水至30 ml。置370 ℃ 10 min，然后加TEM上一页 [1] [2] [3] 下一页
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