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干扰素对人甲状腺细胞表面抗原表达的影响 |
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mportant role in the initiation and perpetuation of postpartum thyroiditis.
【Key words】 Interferon Thyrocyte Autoimmunity Costimulatory signal Thyroid peroxidase
(Chin J Endocrinol Metab, 1999,15:134-137)
干扰素是一组具有生物学作用的蛋白质，它不仅能抗病毒、抗肿瘤，而且有免疫调节作用。临床广泛应用IFN-α治疗丙型病毒性肝炎和恶性肿瘤，其可诱发和加重自身免疫性甲状腺病(AITD)的现象也得到了普遍关注。我们曾在外周血单个核细胞(PBMC)水平进行研究，发现IFN-α的致病作用可能与抑制性T细胞(Ts)功能低下，B细胞、巨噬细胞功能亢进有关〔1〕。本文拟从AITD的靶细胞—甲状腺细胞水平，研究IFN-α对甲状腺细胞表面抗原表达的影响，进一步探讨IFN-α导致AITD的作用机理。
对象和方法
一、实验对象
甲状腺组织来自6名因创伤而死亡的正常人，死后1小时内取下甲状腺。女性4例，男性2例，年龄为18～56岁。死亡前采取静脉血标本。甲状腺功能(FT3、FT4及rT3)和血清促甲状腺激素(TSH)正常。甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)，甲状腺球蛋白抗体(TGAb)、甲状腺TSH受体抗体(TRAb)均阴性。
二、实验试剂
1.刺激因子：IFN-α：来自人类淋巴母细胞，1 000 000U/vial,Sigma；IFN-γ：来自基因工程，50μg，Gibco；TSH：来自牛垂体，10U/vial,Sigma；催乳素(PRL)：来自羊垂体，1mg/vial,Sigma。
2.单克隆抗体：FITC或PE标记的抗HLA-DR、CD54(ICAM-1)、CD80(B7.1)单克隆抗体，鼠IgG1对照抗体，羊抗鼠Ig的单克隆抗体，均来自Becton Dickinson(美国)或Serotec(英国)公司。TPO抗体由上海市内分泌研究所陈春荣博士赠送。
三、实验方法
1.甲状腺细胞的制备：将甲状腺组织去掉包膜，剪成1mm×1mm×1mm小块，加入1mg/ml胶原酶和4mg/ml Dispase，于37℃水浴消化2小时，其间每隔5分钟轻轻振荡一次。将消化后的悬浊液离心5分钟，1 000转/分。弃上清，加入Hanks 液，经200目尼龙网过滤后洗涤。加入含10%FCS和100U/ml青链霉素的RPMI-1640培养液，接种至75cm2培养瓶中。在37℃、5%CO2、95%相对湿度条件下培养6小时后，彻底冲洗以去除未粘附的细胞，待细胞铺成单层时，再次冲洗，加入10mmol/L Hepes和3mg/ml EDTA消化，将消化下的细胞以每孔3×105个接种至24孔细胞培养板(Nude,美国)。细胞生长至融合状态时，加入刺激因子：IFN-α(0.1、1、10、100、1 000U/ml)，IFN-γ(100U/ml)，TSH(10mU/ml)，PRL(10ng/ml)。孵育72小时，用10mmol/L Hepes和3mg/ml EDTA消化后制成悬液。
2.免疫荧光染色：将细胞悬液调整至1×105个细胞/孔，加入96孔锥型底的微量滴定板中，加入冷PBA(等渗磷酸盐缓冲液+0.1%牛血清白蛋白+0.01%叠氮钠)200μl洗涤。(1)直接免疫荧光染色：加入FITC或PE标记的HLA-DR、CD54、CD80和小鼠IgG1(对照)的单克隆抗体，孵育30分钟，4℃，避光。经冷磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.40,0.01 mol/L)洗涤二次后，用1%副醛固定。(2)间接免疫荧光染色：将未标记的TPOAb及小鼠IgG1(对照)加入滴定板中，孵育30分钟，4℃，避光。用冷PBS洗涤后，加入羊抗鼠Ig-FITC，孵育30分钟，4℃，避光。洗涤二次，用1%副醛固定。
3.流式细胞仪测定：将细胞置于FACS管，8小时内上机，每分钟检测1×104个细胞，每管样品分析10 000个细胞。观察指标：1×104个细胞的阳性百分比(去除非特异性染色)和荧光强度。
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