|
瘦素对肝细胞葡萄糖氧化及葡萄糖激酶基因表达的影响 |
| |
glucose oxidation in liver cells. A relatively high dose of leptin has a dose dependent inhibitory effect on glucose oxidation in liver cells. This effect is at least partly brought about by the inhibition of glucokinase gene expression.
【Key words】 Liver cell Glucose oxidation Glucokinase Leptin
(Chin J Endocrinol Metab, 1999,15：131-133)
随着社会物质文明的发展，肥胖症的发病率越来越高。肥胖者容易发生脂、糖代谢异常及胰岛素抵抗，其糖尿病的发生率较非肥胖者明显增高。肥胖已成为严重危害人们心身健康的社会问题。瘦素(Leptin) 基 因及其产物瘦素的发现，为进一步探索肥胖症及其并发症发生的机制提供了新途径。研究证实，人类肥胖者，由于存在瘦素抵抗，表现为高瘦素血症，这种高瘦素血症是否与肥胖者的代谢异常及肥胖相关疾病如糖尿病发生有关，是目前肥胖症研究的重点课题之一。本文拟通过观察瘦素对培养肝细胞葡萄糖氧化及其代谢关键酶葡萄糖激酶表达的影响，初步探讨瘦素对糖代谢可能存在的影响。
材料和方法
一、材料与试剂
正常大鼠肝细胞株BRL(上海细胞生物研究所)，RPMI 1640培养基(Gibcol BRL公司)，Leptin(R&D公司)，D-〔U-14C〕葡萄糖(中国科学院核医学技术中心)，TRIzol Reagent(Gibcol BRL公司)，TitanTM One Tube RT-PCR试剂盒(BM公司)，闪烁液POP、POPOP(Sigma公司)。
二、肝细胞的培养与处理
正常大鼠肝细胞株BRL，于含10%小牛血清(BSA)、1%双抗(青霉素、链霉素)的RPMI 1640培养液中，在5%CO2，37℃条件下，于CO2培养箱中进行培养。每2天换液一次。选择生长良好的细胞进行如下实验：细胞分不加Leptin(空白对照)、加终浓度分别为10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L的Leptin处理、以及胰岛素10nmol/L处理(阳性对照)六种条件，每种条件重复3次以上，于培养1小时后进行葡萄糖氧化检测，其中空白对照组与Leptin 100μg/L处理组检测葡萄糖激酶基因表达。
三、肝细胞葡萄糖氧化检测
参照文献〔1〕方法，以液体闪烁计数法检测葡萄糖氧化：细胞于含0.5%BSA RPMI 1640培养液中预培养3天。胰酶消化，离心收集细胞，细胞再以含5.6mmol/L葡萄糖、Hepes 10mmol/L的RPMI 1640培养液，于硅化瓶内培养1小时。加D-〔U-14C〕葡萄糖(0.1μCi/μl，放射性比活度为248mCi/mmol)0.1μCi/ml，处理组同时加入相应浓度Leptin或胰岛素。于培养瓶内悬挂一小管，胶塞密封瓶口，继续培养1小时。加10%三氯醋酸0.2ml终止反应，并于悬挂的小管内注入氢氧化海胺0.3ml，以捕获CO2。室温放置3小时，小管内加入闪烁液，液体闪烁计数器(LS 3801，Bechman公司)检测放射活性。检测的批内变异系数为3.1%。
四、细胞总RNA抽提
细胞分加与不加Leptin 100μg/L两种条件，于培养瓶中培养1小时，使每一条件细胞数达约1×107。以TRIzol Reagent RNA抽提液充分处理细胞，再以氯仿抽提，异丙醇沉淀细胞总RNA，沉淀以75%乙醇溶解，离心后于灭菌水中，以紫外分光光度仪(PU8800，Philips公司)检测RNA含量与纯度，取OD260/OD280在1.8～2.0之间的RNA进行实验。RNA保存于-70℃冰箱。
五、RT-PCR引物
葡萄糖激酶(GK)引物设计按文献〔2〕报道的引物序列：上游引物为：5 -GGCCACCAAGAAGGAAAAGGT，下游引物为：5 -CCTCTCCCACTTTGACCAGCA，扩增产物长度为253bp。为相对定量检测mRNA表达量，以β-actin作内参照，β-actin引物为试剂盒内附送，上游引物为5 -CCAAGGCCAAC上一页 [1] [2] [3] 下一页
上一个医学论文： 胰岛素样生长因子
下一个医学论文： 干扰素对人甲状腺细胞表面抗原表达的影响
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 内科论文 >> 正文