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人胚胎下丘脑褪黑素受体鉴定及其生物学特性 |
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a公司产品。Tris-HCl缓冲液。
2.膜蛋白提取：胎儿娩出后立即取出下丘脑，加入Tris-HCl缓冲液(1:10)匀浆。低温高速离心44 000g，25分钟，然后洗涤一次，应用Lowry〔8〕法测定蛋白浓度。亚细胞组分提取：先离心1 000g，10分钟，分离出核组织；然后离心27 000g，10分钟，分离出线粒体；再离心100 000g，60分钟，分离出微粒体及胞浆。
3.〔125I〕M特异结合分析
调整蛋白浓度为4～8mg/ml，然后加入不同浓度的〔125I〕M(4～200pmol/L)，非特异结合管加相同浓度〔125I〕M，再加10-6mol/L的非标M，37℃孵育60分钟，应用冷Tris-HCl缓冲液终止反应；然后迅速通过玻璃纤维滤膜(孔径1μm，英国Whatman公司产品)负压吸引，清除游离放射核素，应用γ计数仪(LKB1270)测定滤膜放射活性。应用Scatchard分析检测下丘脑〔125I〕M特异结合最大结合容量(Bmax)及平衡解离常数(Kd)。动力学分析：37℃孵育5、10、20、30、40、60、80、100分钟后测定不同时间特异结合量(结合过程)；孵育40分钟后加入非标M，加M后5、10、20、40、60、80分钟终止反应，研究〔125I〕M解离过程。
4.药物及电解质等对〔125I〕M特异结合的影响
特异性分析：将褪黑素、2-碘褪黑素、6-氯褪黑素、N-乙酰血清素、5-羟色胺、色胺、5-甲氧色胺、吲哚乙酸、去甲肾上腺素、肾上腺素、乙酰胆碱等加入反应体系中，观察对〔125I〕M的取代率。
应用G蛋白结合抑制剂GTPγS〔Guanosine 5 -0(3-thiotriphosphate)〕10和50μmol/L，观察对〔125I〕M特异结合的影响；加入不同浓度的胆碱、Ca、Mg、Na+、K+、Li+，研究电解质对〔125I〕M特异结合的影响。
结果
一、下丘脑〔125I〕M特异结合Scatchard分析
Scatchard分析结果(图1、2)。〔125I〕M特异结合最大结合容量(Bmax)为(1.15±0.32) fmol/mg蛋白；平衡解离常数(Kd)为(36±8)pmol/L。
图1 胎儿下丘脑〔125I〕M特异结合饱和曲线
Fig 1 Saturation curve of 〔125I〕 iodomelatonin binding to human embryonic hypothalamus membrane
图2 胎儿下丘脑〔125I〕M特异结合Scatchard分析
Fig 2 Saturation analysis of specific binding of 〔125I〕 iodomelatonin to human embryonic hypothalamus
二、下丘脑〔125I〕M特异结合动力学分析
下丘脑〔125I〕M特异结合动力学分析结果(图3)；K1为(1.3±0.2×107)mol.L-1.min-1，K-1为(6.3±0.4×10-3)/min，Kd值(48.5±2.1)pmol/L。
图3 胎儿下丘脑〔125I〕M特异结合动力学过程
Fig 3 Kinetic course of 〔125I〕 iodomelatonin binding to human embryonic hypothalamus
三、下丘脑〔125I〕M特异结合特异性分析
各种化合物对〔125I〕M特异结合分析取代率测定结果。可见该结合位点对各化合物的亲和力高低排列为2-碘褪黑素＞褪黑素＞6-氯褪黑素＞N-乙酰血清素＞5-羟色胺＞色胺、5-甲氧色胺、吲哚乙酸＞去甲肾上腺素、肾上腺素、乙酰胆碱。
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