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大多功能蛋白酶2基因与1型糖尿病易感性及发病年龄的关系 |
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2-R/H have a higher risk, and those with LMP2-R/R a decreased risk for 1-DM. There may be no association of LMP2 with the age of onset in 1-DM.
【Key words】 Diabetes mellitus, type 1 Gene Polymerase chain reaction Restriction fragment length polymorphism
(Chin J Endocrinol Metab, 1999,15:153-155)
1型糖尿病(1-DM)是多基因遗传与环境因素相互作用所致的一组异质性疾病，自身免疫紊乱在其发病中起重要作用，近年来的研究发现MHC Ⅱ区的一些基因(DR3、DQA1及DQB1)是其遗传上的易感基因，但这并不能解释1-DM的所有的遗传特征，故许多作用仍在进一步寻找新的与1-DM发病有关的基因。大多功能蛋白酶(LMP)基因是近年来确定的位于MHC Ⅱ区的一个基因座，它有2个基因位点—LMP2及LMP7。LMP2根据其编码产物的第60位氨基酸的不同，分为LMP2-R(第60位氨基酸为精氨酸)和LMP2-H(第60位氨基酸为组氨酸)2种等位基因，有3种基因型—LMP2-R/R、LMP2-R/H及LMP2-H/H。本研究初步探讨LMP2各基因型及等位基因与1-DM易感性及其发病年龄的关系。
对象和方法
一、对象
157例无亲属关系的华南地区汉人参加本研究，其中1-DM患者71例(男40例，女31例)，正常对照86例(男46例，女40例)。1-DM根据1985年WHO的诊断标准；根据发病年龄将其分为3组：A组，≤14岁组；B组，15～30岁组；C组，≥31岁组。正常对照为无遗传性疾病及自身免疫性疾病家族史的健康人。
二、方法
1.DNA的提取：3ml静脉全血肝素抗凝，饱和酚/氯仿抽提。
2.LMP2基因分型：采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术〔1〕。(1)先以PCR技术扩增出含有LMP2基因多态性位点(R/H-60)的DNA片段。PCR引物序列为：LMP2-1，5 -GGCAGCAAGAGCCGAAACAAG-3 ;LMP2-2,5 -GTGAACCGAGTGTTTGAGAAGC-3。PCR：50μl反应混合物中含有：基因组DNA 100ng(2μl)、引物(0.8μmol/L)、dNTP(0.2μmol/L)、10×PCR缓冲液5μL、Taq酶1.5U(华美公司)；热循环参数为：94℃变性50秒，52℃退火60秒，72℃延伸60秒，共35循环，第一循环前94℃预变性7分钟，最后一个循环结束后72℃延伸5分钟。引物由上海细胞生物研究所赛尔公司合成。(2)限制性内切酶-Hha Ⅰ(Gibco公司)对PCR产物的消化：反应体积为20μl，内含PCR产物10μl、10×内切酶缓冲液2μl、Hha Ⅰ 10U(1μl)，37℃孵育过夜。PCR产物10μl及Hha Ⅰ消化产物20μl均置2.0%琼脂糖(含0.5μg/ml溴化乙锭)电泳，紫外线显影、摄片(图1)。(3)质量控制：对70份标本重复进行LMP2基因分型；为保证内切酶消化完全，每次酶切反应均以LMP2-R/R阳性标本作对照。
图1 LMP2基因分型
Fig 1 Genotypes of LMP2 by PCR-RFLP
1，3，5: PCR产物 productions of PCR; 2：LMP2-R/H; 4：LMP2-R/R; 6：LMP2-H/H; 7：pGEM-7Zf(+)/HaeⅢ Markers
3.统计学分析：基因型及等位基因频率在1-DM组与对照组间比较用四格表χ2检验，并计算优势比(Ψ)；1-DM各发病年龄组间基因型及等位基因频率比较采用R×C行列表χ2检验。
结果
一、LMP2基因分型
图1显示PCR产物(252碱基对)及PCR产物的内切酶Hha I消化结果。等位基因LMP2-R含有Hha I的酶切位点，而LMP2-H无Hha I的酶切位点上一页 [1] [2] [3] 下一页
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