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逆转录 |
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戴二黑 刘月梅 冯建荣 崔荣辉 马艾 和玉平
丁型肝炎病毒(HDV)是一种缺陷性共价闭环单股负链RNA病毒，长约1700个核苷酸，由于HDV RNA G+C含量高易形成二级结构以及易变异等原因使逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)成功率不高［1，2］。我们根据Chao等［3］报道的HDV RNA序列建立了一种RT-PCR方法，并对43份肝炎血清进行了检测，现报道如下。
材料与方法
一、血清标本
3份HDV RNA阳性血清，由北京市肝炎研究所黄德庄教授赠送。23例血清HDV标志阳性患者均系在我院住院患者。其中HDAg阳性10例，抗-HD-IgM阳性1例，抗-HD阳性8例，HDAg与抗-HD-IgM阳性2例，HDAg与抗-HD阳性2例。另外17例HBsAg、HBeAg和抗-HBc阳性且HDV标志阴性患者。
二、引物设计
根据Chao等［3］报道的序列，选择HDV基因组的保守区序列设计引物，引物1为5′-TGGGCAACATTCCGAGGGAC-3′，与HDV的核酸序列725～745位互补；引物2为5′-TTCGGGTCGGCATGGCATCT-3′与HDV的887～906位互补，由中国科学院北京科海医疗生物工程公司合成，扩增长度为181bp。
三、HDV RNA提取
取血清50μl，加100μl裂解液(含12g异硫氰酸胍，10ml 1mol/L Tris HCl pH 6.4,2.2ml 0.2mol/L EDTA,0.26ml Triton X-100)加玻璃粉液20μl混匀。室温间歇振荡45分钟。然后用50%乙醇10mmol Tris pH 7.4 1mmol EDTA 5mmol NaCl洗2次。沉淀加去离子水20μl，56℃10分钟然后离心。
四、cDNA合成
20×dNTP 1μl、引物2(15μmol/L)1μl、5×RT buffer 5μl、提取液16.5μl，70℃5分钟然后加AMV 8U和RNasin 20U，42℃水浴1小时，95℃灭活5分钟。
五、PCR扩增
引物1和2(5μmol/L)各2μl，10×buffer 5μl、1×dNTP 2μl、Taq酶1U、逆转录产物2μl、去离子水37μl、石蜡油50μl。94℃预变性3分钟后，按94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分。
六、PCR反应产物分析
(一) 扩增产物电泳分析 取10μl反应产物加2μl溴酚蓝缓冲液，在2%琼脂糖凝胶(含EB50μg/ml)中电泳，100伏，30分钟，紫外检测仪下观察，在DNA分子标记181bp处出现荧光带者为阳性，否则为阴性。
(二) 限制性内切酶鉴定 PCR阳性反应产物提取DNA后，分别用XbaI内切酶和TaqI内切酶进行酶切分析，分别于第59bp和122bp处以及78bp和103bp处有阳性带者为酶切阳性。
七、HDV标志检测
采用ELISA法检测患者血清HDAg、抗-HD和抗-HD-IgM，试剂由北京市肝炎研究所提供。
结果
一、RT-PCR扩增产物及酶切鉴定
用已证实HDV RNA阳性血清进行RT-PCR检测，可见产物为单一核酸条带，位于267bp和174bp之间，与由引物推算的产物大小181bp一致。将该靶基因序列经计算机酶切位点分析，发现存在2个酶切位点：(1) XbaI内切酶位点，能将扩增产物切为59bp和122bp 2个片段；(2) TaqI内切酶位点，能将扩增产物切为78bp和103bp 2个片段。电泳结果与之相等(图1)。
1：XbaI酶切后；2：未经酶切；3：TaqI酶切后；M：DNA分子量标记PGEM-7Zf(+)/HaeⅢ
图1 RT-PCR扩增产物及其酶切结果
二、敏感性和特异性
所有3例已证实HDV RNA阳性血清经RT-PCR检测均阳性。17例HDV标志阴性血清未检测到HDV RNA。
三、HDV标志阳性血清标本检测结果
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