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多聚酶链反应诊断生殖支原体感染的研究 |
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将已知支原体量的Mg G-37培养液用Mg培养基作系列梯度稀释，分别取105 CCU～1 CCU支原体量作模板分别进行3对引物的PCR扩增。
七、酶切鉴定PCR产物
在一灭菌的Eppendorf管内将5μl PCR阳性扩增产物，与10×酶缓冲液，BSA(终浓度0.1mg/ml)，限制性内切酶EcoR I或Alu I 5U，无菌去离子水补足20μl，混匀，短时离心，37℃水浴2～3小时，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。
八、统计学分析
采用四格表的确切概率法。
结果
一、PCR的特异性
经3对引物PCR分别检测，Mg G-37分别有281bp、371bp、374bp的特异扩增带。Mp、Mh、Uu、CT、NG等其它支原体、螺原体、细菌均无任何特异扩增带出现。3对引物扩增产物经限制性内切酶EcoR I或Alu I消化分别产生了45bp与236bp、96bp与277bp、84bp与290bp的2个片段。
二、PCR的敏感性
将105 CCU的Mg作10倍系列梯度稀释至1CCU 3对引物PCR分别检测Mg的敏感性均达10 CCU的支原体量。
三、Mg的感染率
200例STD门诊患者标本经3对引物PCR分别检测Mg，有12例为Mg阳性，阳性率为6%(12/200)，其中男9例，阳性率为6.12%(9/147)；女3例，阳性率为5.66%(3/53)。Mg阳性率在性别上差异无显著性(χ2=0.048,P>0.05)。在12例Mg阳性患者中，存在其它病原体混合感染，有7例合并细菌感染，1例合并HPV感染，2例合并Uu、Mh感染，1例合并CT感染。
四、限制性内切酶酶切Mg标准株及临床标本3对引物的PCR扩增片段
除12例临床标本扩增的371bp片段缺失EcoR I酶切位点外，其余都产生了预期的两个片段。
讨论
本研究以Mg 140 000 MgPa基因序列为靶序列，设计合成了3对引物用于检测Mg。在特异性试验中，3对引物对Mg标准株均分别扩增出相应的特异DNA片段，而肺炎支原体等其它的支原体、螺原体和细菌未扩增出任何片段。用限制性内切酶酶切扩增产物分别产生了预期的两个片段。说明这3对引物具有良好的特异性。3对引物PCR的敏感性均达10 CCU的Mg。应用3对引物分别进行PCR检测临床标本的结果是一致的，阳性率为6%(12/200)，与国外报告的5%～27%［5］下限基本一致。其中男、女性感染率无明显差别。但研究中发现用引物MGS-1/MGS-4的所有临床标本PCR扩增产物缺失限制性内切酶EcoR I酶切位点。这可能与基因发生变异有关。文献报道［2，3，6］在扩增MgPa基因序列也发现MgPa基因序列在Mg各株之间有明显的异质性，其差异表现为硷基插入、点突变及某些限制性内切酶酶切位点的消失或限制性长度多态性上的差异等。MgPa基因5′端EcoR I酶切位点的缺失及用不同的引物进行临床检测时出现漏检的情况或扩增Mg DNA的失败［2，7］，可能反映了MgPa基因的变异或Mg株地理上的差异或由于点突变［2］。在引物3′端的变异将阻止有效的扩增产生假阴性或Mg不同的型株因MgPa基因序列不同就不可能被检测到［7］。用不同的引物检测Mg株或临床标本所获结果不同，表明选择合适的引物是非常重要的。
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