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核酶细胞内抗丙型肝炎病毒作用的研究 |
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(HCV)感染的细胞模型中进行HCV特异性锤头状核酶抑制HCV复制的研究，探 讨核酶抗HCV的效果 和作用机制。
材料和方法
一、材料
(一) HCV感染MT-2细胞模型 MT-2细胞为人CD4+T细胞株，按照Kato等［3］报道 的方法制备。
(二) HCV 5′非编码区(NC)及核心区(C)核酶基因及相应的反义引物 根据Sakamoto等 ［4］报道的序列，在德国Luebeck医科大学微生物研究所合成。
(三) 其他主要试剂 TA克隆试剂为美国Invitrogen公司产品，以多聚酶链反应产物克隆载 体2.1(PCR 2.1)为载体，在插入片 段两侧各有一个Eco RI位点。真核表达载体pSV2-gpt.CD-SRα由日本九洲大学免疫学研究 所王继扬博士赠送，该质粒带有SV40启动子、信号肽及poly A序列，并带有大肠杆菌的gpt 基 因，该基因编码黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)可将黄嘌呤转化为鸟苷酸(GMP)的前 体——黄苷酸(XMP)，因此可恢复共转染后的受体细胞在XHTA-M选择性培养基(含20%胎 牛血清 、250 μg/ml黄嘌呤、15 μg/ml次黄嘌呤、10 μg/ml胸腺嘧啶、2 μg/ml氨基喋呤和25 μg/ml霉酚酸的1×RPMI 1640培养基，pH 7.4)中被霉酚酸和氨基喋呤阻断的哺乳细胞 的GMP 生物合成途径。外源片段插入该载体的Eco RI位点后转染真核细胞，经gpt筛选可获得稳定 表达的重组体。地高辛(Dig)DNA 3′末端标记试剂盒以及核酸检测试剂盒为德国Boehring M annheim公司产品。
二、方法
(一) 抗HCV核酶与pSV2-gpt.CD-SRα的重组 在Taq DNA聚合酶作用下，分别将HCV NC及C 区 核酶基因补成双链，按试剂盒说明书进行TA克隆，转化TOP 10F菌株，经用含有氨苄青霉素 和 X-gel/IPTG的选择性平板作抗性和蓝、白斑筛选，挑出重组克隆后，扩增并纯化重组体， 用内切酶Eco RI进行酶切反应，然后进行琼脂糖电泳，回收和纯化目的片段，按分子克隆常 规插入pSV2-gpt.CD-SRα载体中。为了鉴别抑制HCV复制的作用是来自核酶的切割还是反 义核酸的封闭，以同样的方法构建与HCV C区核酶基因相同但在核酶活性区中有一点突变的 对照重组体，方法与上述相同。上述重组体用相应的探针作斑点杂交后选出阳性克隆，HCV NC区、C区核酶基因及点突变的C区核酶基因分别命名为HCRZNC、HCRZC和HCRZCM。
(二) HCV感染MT-2细胞 用HCV阳性血清感染MT-2细胞后，动态收获部分细胞，用Trizo l试剂提取总RNA，进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测HCV RNA及其复制中间体，并以 Southern杂交证实，确定HCV感染成功及其感染的时间。
(三) HCV核酶重组体转染HCV感染的MT-2细胞 HCV感染后的MT-2细胞培养至第5天，用磷 酸钙转染法将上述HCRZNC、HCRZC和HCRZCM重组体转染细胞，操作方法参见文献［5］。转 染细胞培养60 h后收获并洗涤，加XHTA-M选择性培养基重悬细胞，继续培养。
(四) 细胞RNA的提取和检测 于转染后第3、6、9天各收获3×105细胞，用Trizol试剂 抽提总RNA，并以DNase I酶消化后进行如下检测：1.HCV RNA定性检测按先前报道的方法进 行［6］。2.Southern杂交按试剂盒说明书，以HCV NC、C区核酶基因、点突变的C区 核 酶基因寡核苷酸片段及HCV C区寡核苷酸引物分别用Dig进行DNA 3′末端标记。PCR产物电泳 后 ，进行Southern杂交和显色。3.HCV RNA定量RT-PCR检测采用HCV RNA定量检测试剂盒(Ro che Amplicor HCV Monitor TM Test，瑞士Roche公司产品)，对第9天收获的细胞进行定量 检测。操作按说明书，并设对照。
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