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抗丙型肝炎病毒5 非编码区核酶在细胞内对病毒翻译启动的抑制作用 |
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，CO2孵箱中培养。
二、质粒DNA的细胞转染
核酶真核表达载体Rz213(pcEM213)和Rz260(pcEM260)由本室自行设计构建，并经测序和体外 切割证明［2］。靶基因pCMVNCRluc含有HCV 5′NCR和C区66 nt，并与luc基因融合， 由德国Alt 教授惠赠［3］。首先制备转染质粒，在无菌条件下取经聚乙二醇(PEG)纯化的质粒20 μg溶于100μl双蒸水(ddH2O)，用无血清RPMI 1640稀释至1 μg/μl，-20℃保存备用 。转染前16～20h，用胰酶消化HHCC细胞，接种细胞于6孔培养板(1×105/孔)，37℃，待细胞生长至50%～70% 融合时即可转染。转染方法按试剂盒说明操作(Lipofectamin为Gibco产品)。37℃培养6～16 h，吸去转染液，换含20%小牛血清RPMI 1640培养液，继续培养传代，不同时间收集细胞。
三、细胞的收集与提取液的制备
培养至预定时间的细胞，弃去培养液，用预冷的灭菌PBS洗细胞2次，根据细胞数加入100～200ml细胞裂解液，置室温15 min，待细胞裂解完全时，用橡皮刮取细胞及裂解液，将其转移至1.5 ml Eppendorf管，离心，收集上清，-70℃保存。
四、荧光素酶(luc)的活性检测
按试剂盒说明操作(Luciferase assay system为Promega产品)。取20 μl细胞裂解液，加入 1.5 ml Eppendorf管，加100 μl luc测试液，混匀；尽快用液体闪烁计数仪计1 min的cpm 值［5］。同时用Braford法测定20 μl裂解液中的蛋白含量，最后核算成每μg蛋白 所含的计数值。
五、统计学分析
本文中数据均以均值加减标准差表示(±s)。两组间比较采用t 检验。
结果
一、luc基因在HHCC细胞中的表达
pCMVNCRluc为一瞬时表达载体，当转染于HHCC细胞后，表达luc的活性随细胞转染后的时间 延长而下降。因此，我们分别于转染后48、72、96、120 h和10 d不同时间收集细胞，裂解 保留上清，检测luc的活性，以液体闪烁计数仪测得的每分钟计数(cpm值)，用每μg蛋白所 含的 计数值表示luc的活性。结果表明，pCMVNCRluc载体能在HHCC细胞内有效表达，转染后48 h luc的活性最高，第2和第3天之间差异无显著性(P>0.05)，第4天明显下降(与第2天比 较P<0.01)，第10天降至本底水平(图1)。
二、Rz213与pCMVNCRluc共转染对luc活性
图1 pCMVNCRluc在HHCC细胞内的表达的抑制作用
将Rz213和pcDNA3(空载体作为对照)分别与pCMVNCRluc靶基因共转染HHCC细胞，分别于 转染 后第2、3、4、5、10、15和20天不同时间收集细胞，检测luc的活性，结果见图2。Rz213对l uc表达有明显的抑制作用，两组间在第3、4和第5天差异均有显著性(P<0.001)。
图2 Rz213与pCMVNCRluc共转染对luc表达抑制作 用
三、Rz213与Rz260对细胞luc活性表达的比较
213和260两个位点的锤头结构Rz，体外切割研究显示，两Rz均可特异性切割靶基因。为了解 两Rz在细胞内的作用，我们比较了两Rz分别与pCMVNCRluc共转染对luc活性的抑制作用，以 同一时间点的对照组cpm值为100%，计算Rz组的抑制率(对照组cpm-Rz组cpm/cpm×100)。结 果表明，Rz213和Rz260在转染后第3、4、5天的抑制率分别为：Rz213是36.7%、63.1%和51.2 %，Rz260是30%、56.7%和48.5%。
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