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系统性红斑狼疮患者血清中抗55 000表皮抗原抗体与狼疮带关系的初步探讨 |
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王培光 张学军 杨森 杨春俊 王再兴
系统性红斑狼疮(SLE)是一种多系统受累的自身免疫性疾病，血清中存在多种自身抗体，特别是识别细胞核抗原成分的抗核抗体(ANA)和盐水可浸出的核抗原(ENA)抗体。然而关于SLE抗基底膜(BMZ)抗体研究不多。皮肤狼疮带实验(LBT)对SLE的诊断价值早已为国内外学者所肯定，然而关于其形成的机制目前尚未完全阐明。因此本文分别应用热分离法制备的人表皮BMZ提取物和牛胸腺提取物做为抗原免疫印迹检测及间接免疫荧光检查20例SLE患者血清，并同时行狼疮带实验(LBT)，探讨狼疮带形成的机制。
1 材料和方法
1.1 仪器和材料：GL-20G-Ⅱ型冷冻离心机，FD 201型稳流稳压电泳仪，DDY-Ⅲ40B型电泳槽，DYY-Ⅲ28A型电泳槽，DY-B1型脱色摇床，组织匀浆器，硝酸纤维膜(NC，Amersham产品)，Leica冰冻切片机。
1.2 病例选择：SLE 20例，男4例，女16例，年龄14～36岁，平均年龄26岁。SLE的诊断是根据ARA制定的标准。对照组：皮肌炎2例，均为女性，年龄为26岁和48岁；大疱性类天疱疮20例，男13例，女7例，年龄40～81岁，平均年龄56岁；正常人10例，男2例，女8例，年龄22～40岁，平均年龄30岁。
1.3 热分离表皮BMZ抗原的制备［1］：取自我院外科手术切除下来的正常皮肤，去除皮下脂肪，削至0.5 mm左右厚度，用预冷的PBS反复冲洗后切成2 cm×2 cm大小皮片，先放入37 ℃热分离缓冲液中10 min，快速冷却，轻轻分离表皮和真皮，表皮充分剪碎，置于组织匀浆器中，加入热分离表皮提取液(按每25 cm2表皮加入1 ml提取液)充分匀浆，匀浆物置于液氮中反复冻融10 min×3次，匀浆物以12 000 r/min，4 ℃离心30 min，吸取上清液，重复离心一次，吸取上清，分装，－30 ℃保存。
1.4 免疫印迹的测定［2］：采用7.5%分离胶和4%浓缩胶。表皮提取物经SDS-PAGE和转移电泳，将抗原转印至硝酸纤维膜(NC)上。NC置于0.05% Tween-20%-3% BSA-PBS封闭1～2 h，切成3 mm宽，置于反应槽内，加入经血清稀释液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，含0.5 mol/L NaCl，0.5% BSA，0.3% Tween-20)1∶10稀释的待检血清，室温平缓摇动1 h，倾去反应液，用洗涤液(10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，含0.5 mol/L NaCl，0.3% Tween-20)漂洗10 min×4次，加入按1/400稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体(Sigma产品)室温平摇1h，倾去反应液，用洗涤液漂洗10 min×4次，甩干后加入新鲜配制的DAB底物液(0.6 mg/ml DAB，0.03% H2O2)，观察出现较明显区带后用双蒸水冲洗终止反应。
1.5 ENA多肽抗体的测定：ENA多肽抗体谱试剂盒由深圳爱利国科技开发公司提供。检测方法：患者血清用缓冲液1：50稀释加于印迹膜上，37 ℃反应1 h，用含Tween-20的缓冲液冲洗3次后，与辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体反应1 h，用含Tween-20的缓冲液冲洗3次后，印迹膜与显色液反应。标准阳性抗体显色带由试剂盒内提供。
1.6 皮肤间接免疫荧光(IIF)检查：取正常人皮肤，OCT包埋，冰冻切片，厚度为6 μm，加入经0.1 mol/L PBS 1∶20稀释的SLE患者血清37 ℃ 30 min，用0.01 mol/L PBS漂洗3次，加入FITC标记的羊抗人IgG抗体(Sigma产品)，37 ℃ 30 min，然后用0.01 mol/L PBS漂洗3次，干燥后置于荧光显微镜下观察。
1.7 狼疮带实验(LBT)检查：切取SLE患者前臂非暴露部位的皮肤，OCT包埋，冰冻切片，厚度为6 μm，加入FITC标记的羊抗人IgG抗体(Sigma产品)，37 ℃ 30 min，然后用0.01 mol/L PBS漂洗3次，干燥后置于荧光显微镜下观察。
2 结果
2.1 免疫印迹检查结果：热分离法制备的人表皮抗原经SDS-PAGE、转移电泳及与SLE患者血清进行免疫印迹检测，结果发现，11/20例血清中IgG型自身抗体与55 000抗原发生特异性反应，大疱性类天疱疮血清与180 000抗原结合，皮肌炎和正常人血清不结合任何区带的抗[1] [2] 下一页
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