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甲状腺激素对新生期大鼠下丘脑Go蛋白 亚单位的影响 |
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构基因的表达〔1〕。本课题组曾应用mRNA体外翻译技术，发现有10种鼠脑蛋白受甲状腺激素的调控〔2〕，进一步表明甲状腺激素具有在基因水平上调节神经细胞发育的重要功能。但既往关于甲状腺激素调节脑发育的分子研究主要集中在一些结构蛋白方面，而对于功能蛋白则关注较少，尤其是信号蛋白和甲状腺激素的关系，迄今为止研究得十分有限。本课题组?年来应用DD-PCR及RT-PCR技术，发现甲状腺激素对新生期Wistar大鼠全脑Goα mRNA表达具有调节作用。基于这样的研究背景，我们采用mRNA原位杂交技术，对甲状腺激素与极为重要的神经内分泌器官——下丘脑部位Goα基因表达之间的调节关系进行系统的定位和定量研究。
材料和方法
一、动物模型的建立
取怀孕15日Wistar雌鼠(中国科学院上海实验动物中心)，随机分为实验组和对照组，各5只，实验组每日灌胃1%丙基硫氧嘧啶(上海朝晖制药厂)1.5ml/100g，直到仔鼠出生后14日或21日为止。
二、FT3及FT4的测定
FT3及FT4的测定采用放射免疫法(上海原子核研究所试剂盒)，FT3，FT4测定的灵敏度分别为0.24pmol/L，0.16pmol/L。试剂盒的批内CV＜5%，批间CV＜10%。
三、脑切片制作
取14日或21日龄甲减和正常Wistar大鼠，1%戊巴比妥麻醉，心脏以30ml生理盐水灌注，再以4%多聚甲醛30ml快速灌注，小心剥离全脑，浸入4%多聚甲醛固定液中，4℃下保持8小时，移入30%的蔗糖溶液中直至脑组织沉下，再进行脑冠状位冰冻切片，片厚25μm，切片放入保护液(300g/L蔗糖，300g/L乙二醇，0.05mol/L PBS)中，置-20℃保存。
四、探针制备
合成Goα寡核苷酸片段，序列为5 -GCCAG-TTGTTTTGACCCTGGTTCGGAGGATGTCCTGC-TC-3 。探针标记采用DIG Oligonucleotide Tailing Kit(Boehringer Manneim)，取100pmol Goα，加入4μl标记缓冲液(0.125mmol/L Tris-HCl1.25 mg/ml BSA pH 6.6)，4μl CoCl2溶液，1μl Dig-dUTP溶液，1μl dATP溶液，1μl末端转移酶，补足体积至20μl，37℃温育15分钟，转置冰上，加1μl终止液，2.5μl LiCl, 75μl冰乙醇，过夜。12000g离心，沉淀以10 μl的灭菌双蒸水溶解，取1μl进行鉴定及定量。
五、原位杂交试验
杂交反应采用DIG Detection Kit(Boehringer Mannheim)。从保护液中挑取切片，置0.1 mol/L PBS中漂洗5分钟，4%多聚甲醛溶液固定5分钟，以0.1mol/L PBS漂洗15分钟，共4次，用含1μg/μl蛋白酶K的TE溶液消化20分钟，0.1 mol/L PBS溶液漂洗15分钟×2次后，在0.25%乙酸酐(含1 mol/L三乙醇胺)中反应10分钟，置含50%甲酰胺的4×SSC中平衡20分钟，转至含500 pg/μl Goα探针及用作阴性对照无关探针的杂交液(50%甲酰胺，20×SSC漂洗，1а%封闭剂)中，37℃反应20小时，再分别以2×SSC，0.1×SSC漂洗，各15分钟2次，将切片加入缓冲液1(1mol/L Tris-HCl ?H 8.0,5mol/L NaCl)中平衡2分钟，缓冲液2(1mol/L Tris-HCl pH 8.0,5mol/L NaCl,0.3% Triton X-100,2%羊血清)中30分钟，将抗DIG抗体Fab段以1:500稀释于缓冲液2中，与切片在室温下反应2小时，缓冲液1漂洗15分钟2次，缓冲液3(1mol/L Tris-HCl pH 9.5,5mol/L NaCl，1mol/L MgCl2)中5分钟，加煥显色液NBT和BCIP，避光6小时，进行漂洗，晾干，透明，封片，照相。
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