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腺相关病毒和人 |
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wp19和包含信号肽的HuIFN-γ的编码区cDNA的重组体。pGEM-1-IFN-γ质粒内带有人IFN-γ cDNA全基因，由军事医学科学院提供。H9细胞株：是本所长期保存的传代细胞株，为有缺陷的CD4+ T淋巴细胞株。
(二)逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和PCR试剂 M-MLV逆转录酶、耐热DNA聚合酶、dNTPs混合液等均购自美国Gibco BRL公司。Hu-IFN-γ引物是根据Devos等［3］的报道合成，其扩增产物为含信号肽的504 bp HuIFN-γ编码区cDNA，由美国Gibco BRL公司合成。上游引物：5′-GCATGAAATATACAAGTTATATCTTGG-3′，下游引物：5′-ATTTACTGGGATGCTCTTCGACC-TC-3′。Oligo(dT)15：购自美国Promega公司。
(三)HuIFN-γ酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂 购自晶美生物工程公司(美国Genzyme公司进口分装)。
(四)培养基试剂 RPMI 1640和Hepes粉剂购自美国Gibco BRL公司；超级小牛血清购自浙江杭州四季青生物制品研究所，按说明书配制。
(五)其他试剂 Trizol Reagent购自美国Gibco BRL公司；DNA酶Ⅰ(RNase-free)购自德国宝灵曼公司。
二、方法
(一)重组体转染H9细胞 用DNA-磷酸钙共沉淀法。首先将大量扩增后的重组体pWIG制成DNA-磷酸钙悬液，静置0.5 h后重悬3×106个H9细胞，置于CO2培养箱内0.5 h后加入含10%小牛血清的1×RPMI 1640，参照文献［4］进行。12 h后更换培养液，60 h后收获细胞。
(二)3组对照细胞的设立 1.转染pwp19的细胞；2.经磷酸钙悬液处理的细胞(不含质粒DNA)；3.未处理细胞。
(三)细胞收获 保留细胞培养上清。用生理盐水洗涤细胞4次后收集细胞，并保留最后1次的细胞洗涤液。同时以Trizol连续抽提实验组和对照组细胞内总RNA、DNA和蛋白质，按照产品说明书进行操作。
(四)PCR检测重组体导入细胞内情况 实验组和对照组细胞内抽提出的DNA以及细胞洗涤液直接用HuIFN-γ引物作PCR。程序为：94℃变性1 min,55℃退火40 s，72℃延伸40 s，三步为一个循环，共35个循环，最后72℃延伸18 min。具体操作参照文献［4］。
(五)RT-PCR检测重组体在细胞内mRNA的表达情况 实验组和对照组细胞内抽提出的总RNA经DNase Ⅰ消化后，以Oligo(dT)15作为逆转录反应的引物，37℃水浴1 h后以HuIFN-γ引物作PCR，反应程序同前。具体操作参照文献［4］。
(六)ELISA检测细胞内HuIFN-γ蛋白的表达情况 实验组和对照组细胞的培养上清和细胞内抽提的蛋白质，按检测试剂盒说明书进行检测。
结果
一、PCR检测重组体导入细胞内情况
经pWIG转染的细胞DNA扩增出504 bp条带，三组对照细胞的DNA和细胞洗涤液均未扩增出504 bp条带，见图1。说明pWIG已成功导入H9细胞内。
1.pGEM-1-IFN-γ的PCR产物(504 bp)；
2.100 bp ladder(Promega公司)；
3.洗涤细胞的0.9% NaCl的PCR产物；
4.转染pWIG细胞的DNA的PCR产物(504 bp)；
5.转染pwp19细胞的DNA的PCR产物；
6.磷酸钙处理细胞的DNA的PCR产物；
7.未处理细胞的DNA的PCR产物
图1 细胞内抽提DNA的PCR结果
1.转染pwp19细胞总RNA的RT-PCR产物；
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