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应用含CpG基序的寡核苷酸增强乙型肝炎病毒基因疫苗诱导的细胞免疫应答 |
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体清除乙型肝炎病毒(HBV)的过程中发挥重要作用［1］。HBV基因疫苗，由于其可诱导机体产生较强且持久的细胞免疫应答，可能具有治疗乙型肝炎的作用。采用佐剂等措施，促进HBV基因疫苗诱导产生更强的细胞免疫应答，可能将增强其治疗效应。最近研究发现，含CpG基序(motif)的寡核苷酸(ODN)具有较强的Th1型免疫佐剂作用［2，3］。为此，我们合成了一段含CpG基序的ODN，构建了编码HBV S蛋白的基因疫苗pCR3.1-S，观察了CpG ODN对HBV基因疫苗诱导Balb/c小鼠产生细胞免疫应答的影响。
材料和方法
一、材料
(一) 细胞系和实验动物 小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0、人肝癌细胞(HHCC)系为本室保存。实验动物采用雌性Balb/c小鼠，6～8周龄，第四军医大学实验动物中心提供。
(二) 质粒和宿主菌 真核表达质粒载体pCR3.1(Invitrogen公司)；含编码adw亚型HBsAg基因s的重组质粒pCR3.1-S，由姚志强教授在比利时鲁汶大学构建；宿主菌JM 109由本室李谨革博士惠赠。
(三) 主要试剂 RPMI-1640培养剂(Sigma公司)；小牛血清(杭州四季青公司)；lipofectamine转染试剂(Gibco公司)；G418、HBsAg纯抗原(北京原平生物技术公司)；链霉素-卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)试剂盒、小鼠抗-HBs(武汉博士德生物工程有限公司)；3H-TdR(中国原子能科学研究院同位素研究所)；Na251CrO4(美国杜邦公司)；ODN 5′-TCAACGTT-3′和5′-TCAAGCTT-3′(上海生物工程公司合成)。
二、方法
(一) 重组质粒的构建 以计算机设计聚合酶链反应(PCR)引物，从HBV感染者血清(adw亚型)中扩增HBV S基因序列；以T-A克隆法将其插入真核表达载体pCR3.1；酶切、电泳鉴定含正向插入S基因片段的重组质粒，命名其为pCR3.1-S。
(二) 重组质粒的细胞表达 以脂质体lipofectamine介导基因转移，将重组质粒与空载体质粒分别转染细胞系Sp2/0、HHCC系。转染48～72 h后，1∶4～1∶8传代并以含G418培养基筛选。不同时间点收获转染细胞并以Western blot法检测HBsAg蛋白的表达。另取不同转染时间点的HHCC制作细胞爬片，以免疫组织化学染色法检测HBsAg蛋白的表达。
(三) CpG ODN的合成 Krieg等［4］曾报道，ODN 5′-TCAACGTT-3′(CpG ODN,含CpG motif “AACGTT”)可在体外诱导小鼠B淋巴增殖及分泌免疫球蛋白等，而ODN 5′-TCAAGCTT-3′(非CpG ODN)无此效应。由此，我们选择合成了这两段ODN分别作为免疫佐剂和对照剂。而且，为增强其核酸酶抗性，对其进行了硫代磷酸骨架修饰。
(四) 免疫接种 按常规方法大量制备重组质粒，聚乙二醇(PEG)纯化，以无菌生理盐水溶解质粒并测定A比值达1.8～2.0。将Balb/c小鼠随机分组，每组小鼠5只。以0.5%盐酸布比卡因、0.1%对羟基苯甲酸甲酯(生理盐水为溶剂)处理小鼠股四头肌［5］。24 h后，以100 μg重组质粒接种处理后肌肉，分别以生理盐水、寡核苷酸5′-TCAACGTT-3′(50 μg*只-1*次-1)、寡核苷酸5′-TCAAGCTT-3′(50 μg*只-1*次-1)作为免疫佐剂。间隔两周加强注射，共接种2次。
(五) 淋巴细胞增殖反应的检测 采用3H-TdR掺入法。2次接种后约1周，取免疫小鼠脾细胞，以含10%小牛血清(FCS)的RPMI-1640培养基调细胞浓度至1～5×109/L，100 μl/孔加入96孔培养板。培养4～6 h后，分别加入10～30 μg/ml纯HBsAg至总体积达200 μl/孔。72 h时每孔加入0.5 μCi 3H-TdR，继续培养12～18 h。以多头细胞收集仪将细胞收获于“9999”型玻璃纤维滤膜上，红外线烤箱烤干后以β计数仪(Backman公司)液闪计数。增殖水平以刺激指数(Stimulation Index,SI)表示，SI=(实验组cpm-仪器本底)/(对照组cpm-仪器本底)。 上一页 [1] [2] [3] 下一页
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