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丙型肝炎病毒非结构蛋白3人源单链抗体的筛选与鉴定 |
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，Wizard质粒DNA提取纯化试剂盒购于Promega公司。其他试剂均为国产分析纯。
二、特异性HCV NS3人源单链噬菌体抗体的筛选
首先将抗体库扩增活化，用噬菌体M13K07侵染后37℃培养12 h，浓缩噬菌体。用HCV NS3抗原(80 μg/ml)包被Nunc培养板，包被液为0.05 mol NaHCO3,pH9.6缓冲液，以小牛血清白蛋白37℃封闭2 h后加入浓缩的噬菌体，室温90 min，用PBST和PBS各快速洗涤20次，以0.1 mol三乙胺洗脱已吸附在平皿上的噬菌体，然后用1 mol Tris(pH7.4)中和，再感染对数生长期的大肠杆菌TG1，培养扩增使噬菌体抗体得到富集。继续重复5次上述“吸附、洗脱、扩增”过程。
三、单链噬菌体抗体阳性克隆的筛选及鉴定
将最后一轮筛选得到的重组菌涂平皿，从中挑选66株单克隆菌株。置于2×TY(氨苄西林100 mg/L)中，37℃培养过夜。加入辅助噬菌体侵染后，30℃培养过夜。上清液用于酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。对筛选得到的阳性克隆重复ELISA检测过程。由于纯化的HCV NS3蛋白保存于含有小牛血清白蛋白中，因而从理论上来讲有可能筛选到小牛血清白蛋白特异性的单链噬菌体抗体。以小牛血清白蛋白作为包被抗原，结合交叉反应情况，最后确定2株识别NS3的特异性克隆。
四、阳性克隆株DNA序列测定
对筛选得到的阳性克隆菌株按照Wizard质粒DNA纯化试剂盒方法提取质粒，由赛百盛生物工程公司采用双脱氧末端终止法，用PE公司ABI 377型仪器进行DNA序列测定。
结果
一、噬菌体抗体库的筛选
以固相化的重组HCV NS3作为抗原，对噬菌体抗体库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选。噬菌体抗体的富集结果见表1。从固相平板洗脱下来的噬菌体数显示了明显的增加趋势，在第5轮筛选后结合到包被NS3抗原平皿的噬菌体与第1轮相比，富集了300倍(富集倍数=第5轮产出率/第1轮产出率)。
表1 亲和吸附筛选对噬菌体抗体的富集
筛选次数 噬菌体数 产出率
投入 捕获
第1轮 2.0×1013 3.0×108 1.5×10-5
第2轮 2.0×1013 2.4×109 1.2×10-4
第3轮 2.5×1012 2.6×109 1.1×10-3
第4轮 3.0×1012 7.0×109 2.3×10-3
第5轮 2.0×1012 9.1×109 4.5×10-3
注：产出率=洗脱的噬菌体数量/所用的噬菌体数量
二、对噬菌体抗体的鉴定
从第5轮筛选后得到的细菌集落中随机挑选66个克隆，用ELISA测定上清液中噬菌体抗体与NS3抗原结合活性。其中有19株ELISA的A值较高。对这些噬菌体抗体进行交叉反应试验后，确定有6株交叉反应较弱，结合2次ELISA重复试验的A值，最后确定2株阳性克隆。如图1所示。
1～6 噬菌体抗体；7 阳性对照；8 阴性对照
图1 6株HCV NS3噬菌体单链抗体的ELISA法鉴定结果
三、阳性克隆株DNA序列测定
对筛选得到的阳性克隆菌株提取质粒，由赛百盛生物工程公司进行DNA序列测定。结果如图2所示。
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