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伤寒杆菌耐喹诺酮类机制分子生物学基础研究 |
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of Salmonella typhi RG1, with change transferred from T to G and led to a substitution of Ser-83→Ala. The mutation might be responsible for the increase of MICs of nalidixic acid, ofloxacin and ciprofloxacin against Salmonella typhi from 2,0.06 and <0.03 to 512, 2, and 1 mg/L respectively. Ser-83→Ala was also a newly discovered substitution in gyrA of Salmonella spp. The results of PCR-RFLP and SSCP were in concordance with results of nucleotide sequencing. Conclusions The mutation of gyrase at the 83rd amino acid maybe play a principal role in the resistance of Salmonella typhi to quinolone.
【Key words】Salmonella typhi; gyrA; Polymerase chain reaction-restrictive fragment length polymorphism; Single strand conformational polymaphism; DNA Sequence
伤寒作为我国常见传染病，氟喹诺酮类作为主要治疗药物已受到广泛认可。近年来耐氟喹诺酮类伤寒杆菌已有报道［1］，我们在实验室利用平板法，从临床分离喹诺酮敏感伤寒杆菌S275筛选出两代耐药菌RG1、RG2，经研究证明，RG1耐药以DNA旋转酶变异与药物主动外流为主，RG2则在RG1基础上有外膜蛋白改变，表明细菌耐喹诺酮类多种机制均可在伤寒杆菌发生。
我们利用分子生物学技术对RG1 DNA旋转酶A(gyrA)与拓扑异构酶IV parC基因喹诺酮类耐药决定区进行了更深入的分子生物学调查，结果如下。
材料与方法
一、菌株
伤寒杆菌S275为我院1996年临床患者血培养分离所得对喹诺酮类敏感的菌株，用平板法筛选其耐药变异株RG1。挑取单个伤寒杆菌S275菌落接种于10 ml Mueller-Hinton肉汤(MHB，1 000 ml含牛肉浸膏5 g，水解酪蛋白17.5 g，可溶性淀粉1.5 g)，过夜培养后，以少许菌液均匀涂布于含4 μg/ml(2×MIC)萘啶酸的Mueller-Hinton琼脂(MHA)，37°C温育48 h后，得耐药变异株RG1，与S275共同用于下列研究。
二、抗菌药物及主要试剂
氧氟沙星(OFLX)由日本第一制药株式会社提供，环丙沙星(CPFX)为太原制药厂提供，萘啶酸(NA)购自Sigma公司。
扩增DNA gyrA上游引物为：5′-TGTCCGAGATGGCCTGAAGC-3′，位于大肠杆菌gyrA 108～127位碱基；下游引物为5′-TGCCGTCATAGTTATCAACG-3′与大肠杆菌gyrA 435～454位碱基互补。拓扑异构酶IV亚单位C基因(parC)上游引物为5′-GTATGCGATGTCTGAACTGG-3′，位于大肠杆菌parC基因第72～92位碱基；下游引物5′-GTGGTGCCGTTAAGCAAA-3′与大肠杆菌parC基因第427～444位碱基互补。上述引物均委托中国科学院微生物研究所基因工程中心合成。合成仪为Beckman Oligo 1000型。dNTP、Taq酶、限制性内切酶Hinf Ⅰ、Wizard聚合酶链反应(PCR)产物纯化试剂盒、DNA银染试剂盒均购自Promega公司；DNA测序试剂盒为Perkin-Elmer之末端标记试剂盒。
三、药敏试验
以试管双倍稀释法测定抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)。过夜生长的细菌，以生理盐水稀释为0.5麦氏单位，加入到倍比稀释抗生素的系列MHB中，使最终接种量为104～105CFU/ml，37°上一页 [1] [2] [3] 下一页
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