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恶性疟原虫富组蛋白 全编码区基因的真核克隆及表达 |
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in pcDNA3/HepG2 eukaryotic system.
【Key words】Plasmodium falciparum; Histidine-rich protein Ⅱ; Gene expression
富组蛋白Ⅱ(HRP Ⅱ)是恶性疟原虫无性期合成并分泌至红细胞外的一种水溶性糖蛋白［1］，它富含组氨酸、丙氨酸和天冬氨酸，并存在丙氨酸-组氨酸-组氨酸(AHH)和丙氨酸-组胺酸-组氨酸-丙氨酸-组胺酸-天冬氨酸(AHHAAD)串接重复序列［2，3］。实验表明，早在环状体开始发育后2～8 h内，即可探测到体外同步培养虫体的培养上清中HRP Ⅱ抗原，并随着红内期发育的不断进行，尤其是当裂殖体破裂时［1］，所释放的量呈不断增长趋势。因此，以HRP Ⅱ循环抗原作为靶分子，用来检测恶性疟原虫感染是理想方法［4］。我们在以往研究基础上，通过克隆HRP Ⅱ全编码区基因，探讨其在真核细胞中的表达，并对表达产物的生物学活性进行分析。
材料和方法
一、材料
(一) 虫株、载体与菌株 恶性疟原虫(FCC1/HN株)、大肠杆菌TG1和肝癌细胞HepG2为本室保种，pcDNA3为InVitrogen公司产品。
(二) 主要试剂 Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、Hind Ⅲ和Bam HI购自Promega公司；抗HRP Ⅱ人工合成九肽(AHHAHHAAD)单克隆抗体为中国预防医学科学院寄生虫病研究所惠赠；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG为华美生物工程公司产品；Lipofectin为Gibco BRL公司产品；丙烯酰胺、N，N′-亚甲双丙烯酰胺和TEMED均为Merck公司产品，其它均为国产分析纯级试剂。
(三) 培养基 胰蛋白胨、酵母抽提物为OXOID公司产品，RPMI 1640为Gibco BRL公司产品，HEPES为ALDRICH公司产品，G418为Boehringer Mannheim公司产品，新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所。
二、方法
(一) HRP Ⅱ全编码区基因的扩增 根据HRP Ⅱ完整基因序列［2，5］，在编码区的上游和下游分别设计合成一对寡聚核苷酸引物(P1 5′-GGCAAGCTTATGGTTTCCTTCTCAAAA-3′和P2 5′-GCGGGATCCTTAATGGCGTAGGCAATG-3′)，并在两端分别引入Hind Ⅲ和Bam HI切点。引物由上海生工生物工程有限公司合成，使用前经15%的PAGE纯化。在0.5 ml Eppendorf管中依次加入：32.75 μl双蒸水、5 μl 10×Buffer、5 μl 2 mmol/L dNTP、1 μl 25 μmol/L P1、1 μl 25 μ mol/L P2、2 μl恶性疟原虫基因组DNA和3 μl 25 mmol/L MgCl2,混匀。95°C预变性5 min，加入0.25 μl Taq DNA聚合酶(5 U/μl)，石蜡油覆盖液面。扩增条件：94°C变性40 s、63°C退火40 s，72°C延伸60 s，循环30次后，72°C保温7 min。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果。
(二) HRP Ⅱ/pcDNA3重组载体的构建与鉴定 将酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后的上述聚合酶链反应(PCR)产物和pcDNA3空质粒分别用Hind Ⅲ和Bam HI双酶切1 h，再经二乙氨乙基(DEAE)膜(Schleicher & Schuell公司产品)电泳回收。酶切PCR产物与载体按5∶1摩尔数比混合，在16°C条件下用T4 DNA连接酶连接过夜，随后转化氯化钙法制备的大肠杆菌TG1感受态细胞。随机挑取含氨苄西林转化平板上生长菌落，碱裂解法抽提其质粒DNA，进行双酶切和PCR鉴定。
(三) HRP Ⅱ/pcDNA3转染HepG2细胞 脂质体法，按产品说明书进行。采用含10%新生牛血清的RPMI 1640培养基培养，G418进行加压筛选、传代培养。收集阳性克隆细胞培养上清，并用葡聚糖凝胶(Dextran Gel 25)进行浓缩［6］。
(四) 表达产物的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western印迹分析 均按常规方法进行［7］。
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