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HLA |
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1.1 研究对象
78例RA患者均符合美国风湿病协会1987年RA分类标准［4］，男性12例，女性66例，年龄(39±10)岁，病程(10±8)年。另选择健康成年人126名作为正常对照组。所有观察对象均为祖籍三代居住武汉地区，无血缘关系的汉族人。两组对象的年龄和性别构成差异无显著性。
1.2 方法
1.2.1 全血DNA的制备：取外周血3 ml，2% EDAT抗凝，常规盐析法提取DNA。
1.2.2 HLA-DR1和HLA-DR4等位基因及其亚型测定：采用PCR-SSP法，按文献［5］略加改进。引物的核苷酸序列、扩增产物长度及其扩增的特异等位基因分别见表1。以β球蛋白基因作为内对照，5′端引物序列为 5′-TATCATGCCTCTTTGCACCA-TTC-3′，3′端引物为5′-AATGCACTGACCTCCCACATTCC-3′，扩增片段长约580 bp。95 ℃预变性5 min，然后按94 ℃变性25 s，64 ℃退火55 s，72 ℃延伸30 s，循环30次，72 ℃再延伸5 min，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察。
表1 应用PCR-SSP进行HLA-DRB1*01，
*04亚型分析的特异性引物核苷酸序列、产物长度及扩增特异性
5′引物 序列(5′-3′) 3′引物 序列(5′-3′) 产物(bp) 扩增特异性(DRB1*04)
5′04 GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA 3′041 GTCCACCGCGGCCCGCT 212 01，02，09
5′04 GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA 3′042 CGCGGCCCGCTCGTCT 206 02
5′04 GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA 3′043 TGCAGTAGGTGTCCACCT 222 03，06，07，11
5′04 GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA 3′044 CTGCAGTAGGTGTCCACCG 223 01，02，04，05，08，09，10
5′04 GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA 3′045 TGTTCCAGTACTCGGCGCT 171 05，09，10，11
5′04 GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA 3′046 CGCTGTCGAAGCGCACGG 111 06
5′04 GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA 3′047 CTGCACTGTGAAGCTCTCAC 260 01，05，07，08，09
5′04 GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA 3′048 CTGCACTGTGAAGCTCTCCA 260 02，03，04，06，10，11
5′引物 序列(5′-3′) 3′引物 序列(5′-3′) 产物(bp) 扩增特异性(DRB1*01)
5′01 TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT 3′A CTGCACTGTGAAGCTCTCAC 255 01，03
5′01 TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT 3′B CTGCACTGTGAAGCTCTCCA 255 02
5′01 TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT 3′C GGCCCGCCTCTGCTCCA 195 01，02
5′01 TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT 3′D CGGCCCGCTCGTCTTCC 195 03
5′01 TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT 3′E TCGCCGCTGCACTGTGAAG 261 04
1.2.3 临床观察指标：包括患者的发病年龄、性别、病程、关节外表现(血管炎、皮下结节、雷诺现象等)、红细胞沉降率(ESR)、上一页 [1] [2] [3] 下一页
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