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抗 型胶原抗体的检测及其在类风湿关节炎中的意义 |
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1.1 一般资料
1.1.1 病人组：为1994年9月至1999年3月在汕头大学医学院第一附属医院风湿科住院、门诊、随访的RA患者，共179例，全部符合1987年美国风湿病协会(ARA)的RA分类标准［2］。其中男性53例，女性126例，年龄17～76岁，平均46.3岁。其中病程1年之内，X线未出现明显骨质破坏者(以下简称早期病例)30例。
1.1.2 对照组：共289例，分为两组：一组为同期在汕头大学医学院第一附属医院风湿科门诊或住院的非RA的其他风湿性疾病患者171例；另一组为正常对照组，共118名。
1.2 抗Ⅱ型胶原抗体的体测
参照Fujii等［1］的方法。
1.2.1 微量反应板的包被及封闭：正常羊血清于62 ℃加热20 min，加入固体Tris (0.05 mol/L)、NaCl (0.15 mol/L)和2 mol/L HCl，调pH值至8备用(BNGS)。天然Ⅱ型胶原在46 ℃水浴中加热20 min，即为变性胶原。
将天然Ⅱ型和变性Ⅱ型胶原分别溶解于0.05 mol/L的醋酸中，浓度为3 mg/ml。0.02 mol/L磷酸缓冲液(PB) pH 7.6稀释胶原溶液，使浓度为40 μg/ml，加入微量反应板孔，每孔100 μl，保鲜膜覆盖，4 ℃过夜。
在与待检血清标本进行温育之前，包被好的微量反应板用含0.05%吐温－20的生理盐水溶液洗涤3次，然后每孔加入100 μl BNGS，室温(24～28 ℃)下封闭30 min，洗涤液洗涤3次。
1.2.2 检测：BNGS稀释待检及阳性对照、阴性对照血清，转入微量反应板的微孔中，设二孔平行，每孔100 μl，同时设空白对照。室温温育2 h，生理盐水-吐温溶液洗涤3次。含25%BNGS的0.1 mol/L TBS pH 8.0溶液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，每反应孔加入100 μl，室温温育2 h，洗涤。将联苯二胺和过氧化氢溶解于柠檬酸-磷酸缓冲液pH 5.0中，使各自浓度分别为0.05%和0.017%，加入反应孔，每孔100 μl，37 ℃温育30 min后每孔加入终止液1.25 mol/L硫酸50 μl终止反应，酶标分光光度计492 nm处测吸光度(A)值。
1.2.3 结果判断：以正常血清的平均A值加3个标准差作为正常值上限，待检血清A值超过者即被认为是阳性。
1.3 统计学处理
计量资料数据采用t检验，计数资料数据采用χ2检验。
2 结果
2.1 ELISA工作浓度的选择：为便于比较，选择工作浓度时以天然Ⅱ型胶原作为包被抗原，测定血清抗天然Ⅱ型胶原抗体水平。
参照文献［3］的方法进行。结果表明，Ⅱ型胶原包被液浓度以40 μg/ml，第二抗体辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG稀释度以1∶400，血清以1∶40稀释为最佳。
2.2 RA患者及对照组血清抗Ⅱ型胶原抗体检测结果：179例RA患者中，抗天然Ⅱ型胶原抗体阳性者40例，阳性率22.3%，显著高于健康人和疾病对照组(3.5%和2.5%)(P＜0.05)；抗变性Ⅱ型胶原抗体阳性者66例，阳性率36.9%，与正常对照组(2.5%)相比差异有极显著性(P＜0.000 1)，与其他风湿病(31.6%)差异不大。30例早期RA患者抗天然Ⅱ型胶原抗体阳性9例，阳性率为30.0%。
抗天然Ⅱ型胶原抗体对RA诊断的敏感性为22.3%，特异性为96.9%，抗变性Ⅱ型胶原抗体对RA诊断的敏感性为36.9%，特异性为80.3%。
2.3 抗Ⅱ型胶原抗体与RA病情的关系：抗天然Ⅱ型胶原抗体阳性患者RF阳性率高于阴性组(79.5%对61.8%，P＝0.041)，病情活动评分较高(8.5±9.5对6.6±1.5，P＝0.027)。抗变性Ⅱ型胶原抗体阳性RA患者血清CRP平均水平较阴性组高(24.8%对19.6%，P＝0.003)。晨僵时间、压痛关节数、肿胀关节数、干燥综合征并发率、类风湿结节的发生率、功能分级二组间无统计学差异。IgG、IgM、IgA、γ-球蛋白，ESR水平、ANA阳性率及滴度、放射学病情进展及使用SAARDs的比例等方面在阳性组与阴性组无差异。抗变性Ⅱ型胶原抗体阳性的早期RA患者ESR、CRP水平较阴性组增高(P＜0.05)。
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