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类风湿关节炎中尿激酶型纤溶酶原激活物及其受体蛋白和基因的表达 |
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re high expressions of uPA and uPAR protein and mRNA in RA synovial tissues,indicating that uPA and uPAR genes may play an important role in the genesis and development of RA;There are different expressions between RA and OA of uPA and uPAR genes,suggesting that the difference may have a closely relation with some clinical manifestations such as the degree and progress of degradation of articular cartilage and bone matrix in RA and OA.
【Key words】 Arthritis,rheumatoid;Osteoarthritis;Urokinase;In situ hybridization;Immunohistochemistry
类风湿关节炎(RA)是一种慢性炎性疾病，其主要病理特征是滑膜细胞高度增生并伴有大量淋巴细胞浸润形成血管翳，血管翳向邻近软骨和骨组织侵袭，导致软骨和骨的破坏，而软骨和骨组织破坏的首要步骤和分子基础则是软骨基质的降解，最终导致进行性的关节软骨和骨的破坏。研究表明，尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)介导的细胞外基质蛋白裂解作用与炎性关节疾病中关节软骨和骨的破坏密切相关［1］。国内对uPA系统与RA的关系研究甚少，国外已有一些该方面报道，但尚未达成共识。为此，本文应用免疫组织化学和原位杂交技术对24例RA和18例骨关节炎(OA)滑膜组织中uPA、uPAR蛋白和mRNA的分布及表达情况进行了研究，旨在从蛋白和mRNA表达两方面探讨RA发生发展过程中，uPA、uPAR基因的作用及其临床意义，为寻找新的RA治疗途径提供依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料：24例RA和18例OA滑膜组织均取自解放军总医院手术切除标本，经常规甲醛固定，石蜡包埋，均经病理组织学检查确诊。RA诊断均符合美国风湿病协会1987年RA诊断标准。OA诊断均符合1991年Altman诊断标准［2］。正常滑膜组织均取自无关节病变的截肢患者。
1.2 组织学检测：用常规苏木素-伊红(HE)染色。
1.3 免疫组织化学检测：主要试剂为SP试剂盒(ZYMED公司)，抗uPA、uPAR鼠单克隆抗体工作浓度分别为1∶100和1∶200(抗体购自上海医科大学分子遗传学研究室)，磷酸缓冲液(PBS)0.01 mol/L，pH 7.4，DAB显色液0.04%。采用常规SP法。结果判断：①结合HE切片，根据苏木素复染后的细胞形态，请病理学专家鉴别滑膜组织中的不同细胞类型；②凡细胞质和(或)细胞膜中出现明显的棕色或棕黄色颗粒为uPA或uPAR蛋白阳性细胞；③参照Szekanecz等［3］的方法根据400倍的高倍镜视野下滑膜组织中的阳性细胞占全部细胞(包括：滑膜衬里细胞，滑膜下层单核细胞、巨噬细胞样细胞及血管内皮细胞)的比例分为：阴性(－)：无阳性细胞或阳性细胞数＜10%；阳性(＋)：阳性细胞占10%～40%；阳性()：40%～70%；阳性()＞70%。
1.4 探针制备：实验所用的uPA和uPAR cDNA探针分别来自载有人uPA cDNA 387 bp Acc I-Bg L Ⅱ片段的PGEM-4Z重组质粒和载有人uPAR cDNA 585 bp BamH Ⅰ片段的PGEM-3Z重组质粒(澳大利亚国立大学王耀教授惠赠)。制备重组质粒DNA，经相应酶切，纯化uPA及uPAR cDNA片段，应用光敏生物素标记。标记方法按军事医学科学院放射医学研究所提供的光敏生物素标记试剂盒操作说明实施。
1.5 原位杂交：按文献［4］方法实施原位杂交检测，BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐)-NBT(硝基四氮唑蓝)显色，光学显微镜下观察，凡细胞质中出现紫蓝色颗粒为阳性杂交信号。阳性强度判断同uPA、uPAR蛋白免疫组织化学的标准。原位杂交实验中，每份标本同时做阴性对照检测，包括杂交液内不加探针进行杂交及先经RNase处理后再进行杂交。
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