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心衰患者淋巴细胞 1 |
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对象与方法
1.研究对象：
对照组：20例，均为健康查体者。男11例，女9例，平均年龄(49.6±14.7)岁。经病史、体检及各种辅助检查排除心、脑、肾、糖尿病等疾患。
观察组：60例，为1997年4月至1998年3月我院心内、心外科住院患者。其中风心病38例，扩心病9例，冠心病13例。依照NYHA建议的心功能分级标准，60例中：心功能Ⅰ级10例，男6例，女4例，平均年龄：(50.1±13.1)岁；心功能Ⅱ级14例，男8例，女6例，平均年龄：(52.3±6.7)岁；心功能Ⅲ级26例，男15例，女11例，平均年龄：(63.4±8.4)岁；心功能Ⅳ级10例，男7例，女3例，平均年龄：(61.2±9.8)岁。
2. 研究方法：
临床观察指标：收集病人年龄、病程(年)、血压、血脂、血糖等指标，并根据身高体重计算体重指数(WI)。对60例住院患者还进行心脏超声检查，了解左室肥厚及左室舒张功能等指标。以左室舒张早期和晚期充盈速度及比值(E、A、E/A)作为评价左室舒张功能的指标［4］。
标本收集：对照组和观察组均取肝素防凝外周静脉血5 mL。
总RNA提取：用Boyum的Ficoll Hypague Gradient提取技术［5］分离淋巴细胞。按异硫氢酸胍一步提取法［6］提取总RNA。总RNA提取后，用分光光度法检测RNA的纯度和浓度。本研究中每标本提取的总RNA的纯度均达到要求。
逆转录(revert transcription,RT):取总RNA 2 μL,加随机引物2 μL，75 ℃预变性5 min，然后冰浴5 min，混匀，依次加入5×buffer 5 μL，4 mMdNTP 3 μL,Rnasin 1 μL。 AMV3 μL,DEPC水9 μL,混匀，42 ℃温育1 h,然后95 ℃ 5 min灭活AMV。总反应体系25 μL，各种反应物终浓度为：dNTP0.48 mmol/L，Mg离子10 mmol/L,KCl 50 mmol/L，Tris-HCl 50 mmol/L。
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR):由于β1-受体mRNA水平不高，故采用PCR技术进行测定。以上述逆转录产物为模板，反应体系：总反应体积 50 μL,RTmix 10 μL,10×buffer 4 μL,引物sense 0.5 μmol/L 1 μL,antisense 0.5 μmol/L，1 μL,4mMdNTP 1.5 μL,混匀，加入DNA合成酶0.4 μL，无Rnase水32.1 μL，石蜡油2滴。PCR变性、退火、延伸温度分别为：94℃45 s,55℃30 s, 72℃60 s,首次循环94℃ 3 min，共30个循环，最后在72℃延伸10 min。
β1-受体引物序列：
Sense 5′—CTC ACC AAC CTC TTC ATC ATG-3′
Antisense 5′—GAA ACG GCG CTC GCA GCT G-3′
引物由上海生物工程技术公司合成，TagDNA聚合酶和dNTP均购自Promega公司。
检测结果判断：采取半定量方法。进行PCR时，对每一标本均分别取5 μL,2.5 μL,1.25 μL,0.7 μL分别进行扩增，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。如四管均有亮带定为“++++”，前三管有亮带，为“+++”，依次类推。
统计学处理：成组设计正态分布的计量资料，用均数±标准差表示，多样本均数比较用单因素方差分析，各组均数之间的差别用Newman Keuls法q检验。成组设计等级计数资料，多样本比较用Kruskal-Walls秩和检验，多样本两两比较用Nemenyi法秩和检验，用Spearsman等级相关分析对两等级资料进行相关性分析。
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