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降钙素基因相关肽对内皮细胞增殖及内皮功能的影响 |
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材料与方法
1.人脐静脉内皮细胞的培养［4］：人脐静脉内皮细胞(ECV304，ATCC CRL-1998)由中国典型物保藏中心提供，经ATCC鉴定证实，其Ⅷ因子抗原表达阳性，生长形态良好且性状稳定。培养液为M199培养基(美国Gibco公司产品)和10%小牛血清(杭州四季青出品)。将ECV304置于CO2培养箱(2300，美国Shel-lab)中培养，定时换液，待细胞生长融合后，用0.125%胰蛋白酶消化传代。
2.实验分组：选用生长良好的ECV 304，制成细胞悬液，以1×105个／mL的浓度接种于T 25培养瓶中，置于CO2培养箱中培养，当细胞60%～70%融合时，更换为无血清培养基，6 h后再次更换无血清培养基，并随机分成对照组和用药组。①对照组加入无血清培养基；②用药组分为5个浓度组，加含CGRP的无血清M 199培养液，药物浓度分别为0.01 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM。各组均培养24 h。24 h后用0.125%胰蛋白酶消化细胞，制成单细胞悬液(1×106个／mL)，并吸出条件培养液离心(1 000 rpm, 10 min)，取上清液用于检测。
3.CGRP对培养的内皮细胞增殖的影响：取各组5×106细胞，用预冷的70%乙醇固定，洗涤后加入RNase 200 μL(1 mg/mL)作用30 min，再加入800 μL碘化丙啶(PI)染色液(100 μg/mL PI， Sigma; 1.0% Triton-Ⅹ 100 Servea;0.9%NaCl)，4℃避光染色30 min，行流式细胞仪(FACSort,美国B.D.公司)分析，每组计数10 000个细胞。
4.CGRP对培养的内皮细胞内Ca2＋水平的影响：在各组细胞悬液中加入终浓度20 μmol/L的Fluo-3-AM,37℃,5%CO2培养箱中孵育80 min，PBC缓冲液洗涤3次，并将细胞重悬于无血清培养基中，用荧光分光光度计进行检测，并按公式计算细胞内Ca2＋浓度。［Ca2＋］i=Kd（F-Fmin))/(Fmax-F),Kd=400 nmol/L。
5.降钙素基因相关肽对内皮细胞培养液中NO、ET水平的影响：取各组条件培养基用于检测NO、ET。NO在水溶液中不稳定，易与分子氧形成NO2，并转化为NO3和NO2，本实验采用硝酸还原酶法测定培养液中NO3和NO2含量以反映NO的水平(NO试剂盒购自南京聚力生物医学工程研究所)，ET的测定则采用放射免疫分析法(ET试剂盒购自东亚免疫技术研究所)。检测步骤按试剂盒说明书进行。
6.统计分析：数据均以（±s)表示，组间比较采用t检验。
结 果
1.CGRP对培养的人脐静脉内皮细胞增殖的影响：与对照组相比，CGRP用药组的S期细胞明显增多，反映增殖情况的增殖指数(PI)均大于对照组，其中以10 nM浓度时作用最强，差异有极显著性(见表1)。
表1 CGRP对培养的人脐静脉内皮细胞增殖的影响
组别 n G0/G1 S ? G2／M PI
对照组 6 61.7±3.03 37.8±3.02 0.5±0.22 38.3±3.04
CGRP 0.01 nM 6 57.4±3.95 41.2±3.92 1.4±1.30 42.6±3.95
CGRP 0.1 nM 6 55.4±4.07 44.1±4.21* 0.5±0.20 44.6±4.07
CGRP 1 nM 6 50.7±2.58 47.2±3.18 2.1±1.62 49.3±2.58
CGRP 10 nM 6 44.4±3.37 54.9±3.51 0.7±0.34 55.6±3.57
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