荧光免疫组织化学染色。
1.2.4 AD大鼠行为学检测〔2〕
采用Y型电迷宫。①学习能力测试：以大鼠受电击后从起步区直接逃至安全区为正确反应，以连续10次中有9次（9/10)正确反应前所需的电击次数（即尝试次数)表示其学习获得能力。②记忆再现测试：上述达标大鼠休息24 h后，同法检测其记忆力。以达9/10标准前的尝试次数表示记忆再现能力。
1.2.5 荧光免疫组织化学染色
迷宫实验结束后各组大鼠快速取脑，常规固定，冠状冰冻切片，片厚30 μm,行荧光免疫组织化学染色。取相邻海马脑切片，4℃丙酮固定10 min，风干； 0.3％ H2O2室温10 min； 0.125％胰酶消化15 min；2％正常山羊血清封闭，室温孵育15 min；滴加一抗（抗NF200抗体，1∶400；抗GFAP抗体，1∶50；抗Glu抗体，1∶200；抗ChAT抗体，1∶400)，4℃孵育24 h；滴加1∶50稀释的TRITC标记IgG，37℃孵育40 min。甘油缓冲液封片。0.02 mol/L PBS做阴性对照。
1.3 统计学处理
全部数据以x±s表示，应用SPSS10.0统计软件包行单因素方差分析。
2 结果
2.1 移植细胞的存活和迁移
2、4、6 w脑片在荧光显微镜下Hoechst33258标记的移植细胞呈黄绿色荧光，细胞大多呈圆形，大小不一。移植后2 w，黄绿色荧光亮点迁移较明显，除移植位点和针道内有密集黄绿色亮点或团块外，部分细胞沿海马回向两侧迁移，并排列成黄绿色条带状。迁移距离随时间而增加，移植2、4、6 w后分别可达2、3、4 mm。移植后6 w，迁移细胞在海马回内，向内侧接近第三脑室，向外侧达到侧脑室上方。
2.2 移植细胞的分化
NSCs移植2 w后，免疫荧光检测无明显NF200、GFAP、Glu、ChAT阳性反应，而移植后4、6 w，则可见免疫阳性反应。Hoechst33258/GFAP双标阳性细胞，主要位于大脑皮层，胞体中央有一个大而圆的核，胞浆少，并可见多个较长的突起（图1)，表明细胞形态已发育成熟。Hoechst33258/NF200双标阳性细胞，主要位于移植细胞的周边部位，其双标阳性细胞的形态已为成熟神经元，表现为胞体中央有一个大而圆的核，胞浆少，细胞膜发起突起，明显可见延伸较长的轴突（图1)。同样，在移植后4、6 w也可见到少量Hoechst33258/Glu双标阳性细胞及Hoechst33258/ChAT双标阳性细胞。前者表型为胞核大，胞浆少，为圆形或椭圆形（图1)；后者表现与前者相似，偶有纤维突起（图1)。
2.3 行为学测试
正常对照组、AD模型组、2、4和6 w移植组学习获得尝试次数分别为34.83±7.59、98.17±1.83、39.50±3.62、38.33±5.87、37.17±5.91；记忆获得尝试次数分别为18.33±4.18、77.17±8.00、21.50±3.49、20.50±4.62、20.33±4.91。结果显示注射Aβ140后，大鼠迷宫学习、记忆能力显著下降（P<0.05)。移植NSCs 2、4、6 w后大鼠学习、记忆能力明显得到恢复，与AD模型组比较有统计学意义（P<0.05)，与正常对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05)。移植后各组间学习、记忆能力差异无统计学意义（P＞0.05)。
3 讨论
本研究表明自新生大鼠海马齿状回分离培养的NSCs在AD大鼠脑内能够存活至少6 w，沿海马回向两侧迁移，并能分化形成神经胶质细胞和神经元，特别是胆碱能、Glu能神经元，有效改善AD模型鼠的学习、记忆能力。对移植的NSCs进行预先标记,以便于了解移植后其存活、迁移和分化情况。本实验选用的Hoechst33258属于Bisbenzimid类的活细胞荧光色素，仅能与双链DNA结合，而对细胞没有太大的细胞毒作用。已有研究发现前脑室下带的NSCs可以通过吻侧迁移流（rostral migration stream，RMS)迁移至嗅球〔4〕。因此，提出神经细胞是沿着胶质细胞的纤维迁移的假说。之后的体外细胞实验中观察到神经细胞沿着辐射状排列的胶质
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