将小鼠肝脏、脾脏、肾脏和肺脏的组织匀浆涂布在培养基上，28℃培养2～3 d。除肺脏出现白色绒毛样丝状真菌菌落外，其他脏器均未见有菌生长。3 d后菌落呈深绿色粉末状，背面淡黄褐色。经小琼脂块培养、乳酸酚棉兰染色，显微镜下可见多呈45°角分支的分生孢子梗，烧瓶状的顶囊，单层小梗位于顶囊上半部，小梗上可见链状排列的球形分生孢子。结合菌落特征和显微镜下形态学特点，初步鉴定为烟曲霉。计数7株菌感染小鼠肺组织匀浆的菌落数量，以Log (CFU/gram)表示，结果见表2。培养至第3天，阴性对照组和正常对照组组织匀浆无菌生长。7个感染组的组织匀浆菌落计数Log值在2.995 4±0.034 1之间，组间差异无统计学意义(P>0.05)，说明7组间小鼠肺组织匀浆培养得到的菌量一致。表2 7株烟曲霉感染小鼠肺组织匀浆菌落计数（略）
2.6 菌株的分子生物学鉴定
利用真菌通用引物扩增得到约420 bp的线粒体细胞色素b基因片段，见图3。经过DNA序列测定以及序列比对，证实肺组织中分离得到的菌株是烟曲霉。
2.7 小鼠的肺脏组织病理学观察
感染组小鼠肺脏组织切片可见致密、有隔、宽度均一（3 ～ 6 μm）的菌丝，放射状或片状生长。分生孢子梗多呈45°角分支，有时可见菌丝侵入血管，伴有肺组织的充血、出血和炎症细胞浸润。
烟曲霉JLC 50134和JLC 30566感染小鼠的组织病理学变化见图4。结果显示，JLC 50134感染小鼠肺组织有出血和充血，大量孢子萌发成菌丝体（箭头所示），聚集在血管周围并侵入组织，造成肺泡壁的破坏、炎症细胞浸润（图4a）。JLC 30566感染小鼠可见肺组织结构较为完整，仅有少量出血和炎症细胞浸润（图4b）。通过比较7株烟曲霉感染小鼠的生存率、平均体重、组织病理学变化等指标，筛选出了致病力最强的菌株JLC 50134和最弱的菌株JLC 30566。
3 讨论
烟曲霉是一种腐生菌，在环境中分布广泛，且其分生孢子体积微小，极易被人体吸入。若吸入肺泡中的烟曲霉分生孢子逃过宿主的免疫防御系统，就会萌发产生菌丝，侵入肺组织并血行播散至全身引起感染。由于烟曲霉常侵犯免疫力低下的患者，因此选用环磷酰胺腹腔注射造成免疫抑制状态，以提高小鼠对烟曲霉的敏感性。鉴于烟曲霉造成的IPA多为分生孢子经鼻腔吸入肺内所致〔8〕，因此本研究选择鼻腔接种法进行感染，相比气管内接种更加简便快速，对小鼠的伤害较少，能更真实的模拟感染过程，并可避免感染过程中小鼠的意外死亡；此外，该方法容易定量，便于比较不同菌株间致病力的差异。
本研究发现，烟曲霉JLC 50134感染小鼠后，生存率下降最快，造成的病理损害最为严重，而烟曲霉JLC 30566感染小鼠后，生存率下降较慢，病理损害较轻。说明JLC 50134和JLC 30566在致病力上存在显著差异，认为分别是致病力最强和最弱的菌株。目前认为烟曲霉致病机制与很多因素相关，研究表明虽然宿主呼吸道内的纤毛可以有效地清除一些分生孢子，但是真菌分生孢子侵入宿主肺泡内，黏附于肺泡基底膜是感染的第一步〔9〕。同时机体的肺泡巨噬细胞在清除分生孢子并阻断孢子萌发方面也有一定的作用。Paris等〔10〕发现烟曲霉黏附因子缺失突变株仍能在肺内定植。而本研究在比较烟曲霉致病力差异时，发现组织匀浆的菌落计数无显著性差异，说明这几株菌的分生孢子能够黏附并定植于肺组织。这与Paris的研究结果相一致。因此，推断菌株致病性可能与孢子的萌发、分泌水解酶和毒性代谢产物等作用相关。今后致病机制的相关研究将从这些方面深入细致地开展。
【参考文献】
1 Dagenais TR，Keller NP.Pathogenesis of Aspergillus fumigatus in Invasive Aspergillosis〔J〕.Clin Microbiol Rev，2009;22(3):44765.
2 Vonberg RP，Gastmeier P.Nosocomial aspergillosis in outbreak settings〔J〕.J Hosp Infect，2006;63(3):24654.
3 Ma Y，Qiao JJ，L
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