67岁);复发组11例,其中AML 9例，ALL 2例，平均年龄33.6岁(10～49岁);完全缓解(本文中完全缓解的概念是指骨髓象达到完全缓解的标准)组15例，其中男7例，女8例，平均年龄39.2岁(12～67岁)。 CML 10例，男5例，女5例，平均年龄49.6岁(29～78岁)。对照组：14例正常健康人为对照组，男6例，女8例，平均年龄 46岁(22～63岁)。以K562细胞株作为阳性对照。
1.2 方法
1.2.1 血中单个核细胞的分离及RNA的提取 取3ml外周血，用肝素抗凝。经裂解液裂解细胞后，采用硫氰酸胍-酚-氯仿一步法[5]提取细胞总RNA，-80℃保存。RNA质量检测：样品OD260/OD280比值在1.8～2.0之间,可行逆转录反应。
1.2.2 逆转录实验 反应程序：在PE-2400型PCR仪中进行，42℃ 2min后加入M-MLV 25℃ 10min、37℃ 60min、95℃ 5min后冷却至4℃。
1.2.3 PCR反应 反应程序：在PE-2400型PCR仪中进行，PCR的变性、复性、延伸的温度和时间：94℃ 2min后加入Taq酶 94℃ 0.5min、54℃ 1min、72℃ 1min，共35个循环后72℃ 10min，冷却至4℃保存。
1.2.4 引物设计 见表1。
1.2.5 凝胶电泳 在3%的琼脂糖凝胶上以恒压方式电泳，电压60V(电压降为5V/cm)，60min。在紫外透射仪上观察所扩增的电泳带，并照相纪录。所用PCR Marker为DL2000：2000、1000、750、500、250、100bp。
1.2.6 酶切反应 反应程序：37℃ 120min，72℃ 15min后冷却至4℃。酶切产物3%琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪上观察所扩增的电泳带，并照相纪录。
表1 引物设计
1.3 统计学方法 结果用平均数表示，采用χ2检验，以P<0.05为有显著的统计学意义。
2 结果
2.1 正常人及造血系统各种肿瘤WT1基因表达 在AL、CML中WT1基因表达与正常对照组比较，差异均有统计学意义。AL初治、复发及缓解患者中WT1基因阳性率的比较，初治组与复发组相比较，差异无统计学意义;初治组与缓解组相比较，差异有显著的统计学意义。CML慢性期与急变期相比较，差异有显著的统计学意义。见表2。
应用卡方检验，AL组与健康对照组相比较P=0.0004,差异有统计学意义。AL中初治组与复发组相比较P=0.313, 差异无统计学意义;初治组与缓解组相比较P=0.041，差异有统计学意义。CML慢性期与急变期相比较P=0.018，差异有统计学意义，加速期与急变期相比较P=0.400，差异无统计学意义。
表2 血液系统恶性肿瘤患者与正常对照组
2.2 WT1基因各剪接体在AL及CML急性变期中的表达 见表3。
表3 WT1基因各剪接体在AL及CML急性变期中的表达
应用卡方检验,WT1基因的4种剪接体在各种疾病的组间两两比较P>0.05, 差异无统计学意义;4种剪接体在各种疾病中阳性例数的合计数两两比较P>0.05，各组间的差异无显著的统计学意义。
2.3 WT1基因在K562细胞株中表达 呈阳性表达,且4种剪接体均有表达。
3 讨论
WT1基因最先被认为是一种肿瘤抑制基因，近来研究发现WT1基因在白血病细胞中高度表达，并与白血病的发生、发展及预后有关。1992年Miwa等[6]用Northern印记方法首先证实了44%的急性淋巴细胞白血病及68%急性髓细胞白血病中有WT1基因表达，近来一些学者也相继报道WT1基因在白血病细胞株，如K562、HL60、KG1等及白血病患者中有异常的高表达，并发现恶性组织细胞病和骨髓增生异常综合征也有WT1的表达[3，4]。而在正常骨髓细胞及外周血中不表达或表达极低水平的WT1基因(分别为10-3-10-4，10-5)[7]。目前，尚未见国内外有研究白血病中WT1的4种剪接体表达情况的报道，本实验根据WT1存在剪接变体来设计引物，应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定不同类型白血病及其处于不同疾病阶段的患者WT1基因的表达，初步探讨了WT1基因表达与白血病的关系及其意义，以及WT1基因4种不同的剪接体在白血病中的表达情况。本研究发现WT1基因在急性白血病初治组和复发组中的阳性率较高，分别为62.5%和63.6%，
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