螺旋CT三维重建和多平面重建在骨关节损伤中的临床应用

　　1.1.1 实验动物 正常健康Wistar大鼠60只雌雄各半，体重210～230g，由山西医科大学实验动物中心提供。

　　1.1.2 试剂与相关药品 (1)链脲佐菌素(Streptozotoain,STZ sigma)在低温、酸性条件下进行，现配现用。氯沙坦、辛伐他汀由默沙东公司赞助。(2)免疫组化试剂：全套试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司(Boster)。免疫组化试剂采用即用型SABC试剂盒，产品编号为SA1022。(3)放射免疫试剂盒：采用中国原子能科学研究院的白蛋白测定试剂盒查尿白蛋白排泄率(UAER)。

　　1.1.3 仪器设备 (1)实验动物房、代谢笼及制模所需物品。(2)切片机、加样器、烤箱、医用微波炉、温箱等。(3)北京麦克奥迪图像技术有限公司的CMIAS系列-多功能真彩色病理图像分析系统，用于免疫组化切片图像分析。SAS 6.12分析软件，用于数据统计学处理。(4)血糖测定采用德国乐康全血糖仪(葡萄糖氧化酶法),血脂、血肌酐测定采用日立7170A全自动生化分析仪。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物分组、成模及用药 实验动物在分组前进行尿常规检查以除外实验前潜在的尿蛋白阳性情况。随机分为5组，正常对照组(C组，n=8)，糖尿病对照组(D组，n=13)、糖尿病氯沙坦治疗组(D1组，n=13)、糖尿病辛伐他汀治疗组(D2组，n=13)及糖尿病氯沙坦和辛伐他汀联合治疗组(D3组，n=13)。除C组外，其余4组动物在空腹10h(过夜后)后按60mg/kg体重一次性腹腔注射链脲佐菌素溶液，72h后尾静脉采血，用血糖仪测定空腹全血血糖(FBG)，血糖≥16.65mmol/L并持续3天者确认为糖尿病大鼠[1]。实验期间大鼠自由饮水、进食，均不使用胰岛素及其他抗糖尿病药物治疗。每周查尿常规、尿酮体及空腹血糖1次。D1组每日每公斤体重20mg氯沙坦灌胃，D2组每日每公斤体重2mg灌胃，D3组两药合用，用量用法分别同D1、D2组。于成模后第8周末用代谢笼收集12h尿，放射免疫法测定尿白蛋白，同时查各组空腹血糖及血脂、血肌酐指标，全部动物逐个宰杀后取肾脏并反复用生理盐水灌洗后入10%的中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋。

　　1.2.2 HE染色及免疫组化染色 按常规程序进行HE染色。严格按SABC试剂盒要求进行免疫组化染色。NF-κB及PKCα按推荐条件行微波抗原修复。PDGF-B不用抗原修复直接进入下一步。选糖尿病对照组(抗原表达最丰富)用PBS代替相应一抗作为阴性对照。

　　1.2.3 切片图像处理及原始数据采集[2] 免疫组化染色阳性结果判定标准：阳性组织呈棕黄色，阴性部分呈淡蓝色，分布于肾小球系膜细胞的细胞质、胞核、核膜及肾小管上皮细胞的细胞质等部位。用图像采集模块软件，每组切片随机采集30个视野(10～20倍物镜)，用组化分析模块软件对每个视野的肾小球及肾小管/间质进行阳性目标分割、视野编辑(去除非组织视野所占空间等)后，得出每个肾小球视野和肾小管/间质视野阳性目标面密度(阳性染色面积/统计场面积)及阳性单位(代表染色部分的平均吸光度，染色越深，数值越大)，而阳性面密度与阳性单位之乘积可以反映免疫组化阳性目标的总强度，即抗原的总量。为保证测定数据的准确性，对每个统计场的参数进行3次操作，最后取3次参数的均值作为统计场参数进入统计学分析的原始数据。

　　1.2.4 统计学分析 (1)成组设计的方法比较正常对照组与其他4组糖尿病鼠血脂及12h尿白蛋白排泄率(UAER)指标，以确认血脂及UAER在实验过程中的变化。(2)NF-κB、PDGF- B、PKCα三种指标肾小球、肾小管/间质免疫组化阳性面密度、阳性单位及其乘积的变化。 数据均用均数±标准差(±s)表示，使用SAS软件包进行方差分析、q检验、非参数χ2分布概率计算及t检验或t’检验(方差不齐时)。

　　2 结果

　　整个实验过程未见糖尿病酮症酸中毒。

　　2.1 各组之间生化指标的变化 见表1。

　　表1 各组血糖、血肌酐、血脂及UAER的变化 (略)

　　注：与C组比较：*P<0.0001(t’检验 );与D组比较：ΔP<0.0001(t’检验); D1、D2、D3组q检验：#P<0.05(方差分析F:14.67,P<0.0001)

　　由表1可知，成模后各糖尿病组大鼠空腹血糖水平(FBG)明显高于正常对照组(P<0.0001)，而各糖尿病组之间血糖值差异无显著性。各组血脂指标及血肌酐比较差异无显著性。D组UAER在成模后第8周末明显高于

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