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氧自由基和细胞凋亡在大鼠应激性溃疡中的作用

。正常胃黏膜细胞存在凋亡,与细胞增殖共同调节胃黏膜结构和功能的稳态,细胞凋亡和增殖之间的失衡是胃溃疡发生的因素[1]。但其是否在应激性溃疡中存在并发挥作用,以及氧化应激与细胞凋亡之间是否存在相关性,目前尚未知。

  1材料与方法

  1.1实验动物及分组40只雄性Wistar大鼠,体重220~280g,随机分为5组:正常对照组和应激后3、6、12、24h组,每组8只。应激组采用改良Allen法[2]建立颅脑损伤模型。

  1.2溃疡指数(UI)按Guth标准[3]评定。

  1.3胃黏膜SOD、MDA测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供,刮取胃后壁黏膜制备组织匀浆,严格按说明书操作。

  1.4电镜超微结构经多聚甲醛灌注固定后,取大弯侧胃前壁组织,送透射电镜观察。

  1.5早期细胞凋亡检测AV-PI(磷脂酰丝氨酸结合蛋白联合碘化丙啶双标记)试剂盒由BD pharmgen公司提供。刮取剩余胃前壁黏膜制备单细胞悬液,流式细胞仪采样,BD软件计算机分析,计数早期凋亡细胞率。

  1.6统计学分析各组实验数据以均数±标准差(±s)表示,采用SPSS 11.0软件进行t检验及数据间相关分析。

  2实验结果

  2.1胃黏膜大体及UI变化应激后3h胃黏膜偶见轻度充血,UI=0。6h见轻度充血、水肿,少量点状糜烂,UI=3.88±1.27。12h见明显充血,点线状糜烂和新鲜出血灶,UI=12.13±2.96。24h见点线状糜烂、剥脱、小溃疡形成,UI=32.75±8.41。应激后6、12、24h与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。

  2.2透射电镜超微结构变化应激后3h见线粒体嵴轻度肿胀,微绒毛稍多。6h组细胞缩小,核染色质固缩聚集成新月体形的凋亡细胞,胞膜起泡出芽,形成小体及吞噬现象。12h组见大量凋亡细胞。核膜皱褶,细胞器集中,微绒毛消失。尚有部分细胞死亡。24h组死亡细胞增多。线粒体高度肿胀;粗面内质网广泛扩张、脱颗粒。

  2.3胃黏膜SOD、MDA变化胃黏膜SOD活性于应激后3h显著降低,12h达低谷。MDA含量于应激后3h显著升高,6h达高峰。见表1。

  表1各组胃黏膜SOD、MDA变化(略)

  注:为该组与对照组比较P<0.05,ac为相应组间比较,P>0.05

  2.4早期细胞凋亡率检测应激后3h早期细胞凋亡稍增,但与对照组差异无显著性。应激后6h显著增多(P<0.05),于12h达高峰。应激后24h早期凋亡细胞已明显减少,较应激后12h差异有显著性(P<0.05),但仍明显高于对照组(P<0.05)。见表2。

  表2各组早期细胞凋亡百分率变化(略)

  注:为该组与对照组比较,P<0.05,ab为相应组间比较,P<0.05

  2.5SOD、MDA与细胞凋亡相关分析应激后SOD活性与早期细胞凋亡率呈显著负相关(r=-0.713,P<0.05),MDA与早期细胞凋亡率呈显著正相关(r=0.684,P<0.05)。

  3讨论

  本实验观察了应激反应前后大鼠胃黏膜变化,同时检测了氧化应激相关指标SOD和MDA,其消长与黏膜损害程度一致,且开始出现显著性变化的时间早于形态学改变,提示氧化应激是应激性胃黏膜病变的重要损害因素。

  本实验还观察到应激后6h胃黏膜损伤尚不明显,而细胞凋亡已显著增多,并于12h达高峰。应激后24h黏膜明显糜烂、出血和溃疡形成,细胞凋亡却已显著减少,坏死细胞增多,提示细胞凋亡在应激性胃黏膜损害早期明显增加,其参与应激性溃疡形成。应激时,全身神经、体液、激素水平和局部细胞内环境发生变化:内脏血流灌注减少,胃黏膜缺血缺氧,局部微循环障碍,黏膜pH值和通透性改变,细胞内Ca2+浓度升高,可能是导致黏膜上皮细胞凋亡增加的重要机制。同时,胃蠕动减缓,细菌黏附并穿过上皮屏障,引起炎症反应及细胞因子的产生[4]。炎症细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)均可增加体内外细胞的凋亡[5,6],生长因子的缺乏、细菌毒素及缺血-再灌注损伤均可导致大鼠上皮细胞凋亡增加,同时伴有黏膜屏障功能障碍,且通透性与凋亡指数呈正相关[7,8]。可见,黏膜上皮细胞凋亡的增加与黏膜屏障功能受损有关。因而推测,细胞凋亡增加,分化增殖能力下降,不能产生大量新分化细胞及时补充,凋亡速度大于增殖速度;如果损伤性刺激持续存在并达到相当程度,触发基因调节失控,大量坏死

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