RNA干扰研究进展及其在医学中的应用前景

　　【关键词】 RNA干扰

　　随着人类基因组计划的实施，人类已积累了大量的基因序列数据，而这些序列大部分缺乏明确的功能注释。目前随着后基因组时代的到来，基因功能的研究已变得日益重要。RNA干扰(RNA interference，RNAi) [1] 是由与靶基因序列同源的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)所诱导的一种特异性的转录后基因沉默现象(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。它不同于基因敲除(Gene knock-out)使目标基因永久性的表达沉默，而是通过降解具有同源序列靶基因的mRNA，达到阻止基因表达的作用，因此被形象地称为“基因敲低”(Gene knock-down)。

　　1 RNAi的发现过程

　　1995年，Guo等 [2] 利用反义技术研究线虫的基因功能时，发现靶向Par-1的反义RNA可以阻遏该基因的表达，但正义链的导入亦可出现类似现象，据此推测正义链对基因表达有一定的作用，并提出RNAi现象。1998年Fire等 [1] 将靶向Par-1基因的dsRNA的正反义链混合物注入线虫卵中，发现dsRNA抑制靶基因表达的能力至少比任一单链RNA强10倍以上，靶mRNA受到明显的干扰且呈现出可传递给后代的特异表型，因而他们提出了“dsRNA介导的RNA干扰”现象。2000年，Zamore等 [3] 发现:注入果蝇胚胎细胞的dsRNA被切割为21～23nt大小的RNA片段，而同源的内源mRNA只有与dsRNA对应的部位被切割。从而确定基因沉默发生在转录后水平。

　　这种同源降解机制在果蝇、真菌、拟南芥、斑马鱼、小鼠中均存在，说明它在生物中具有普遍性，这些由dsRNA介导的序列特异性基因沉默过程，可能是生物在长期进化过程中形成的一种自我保护机制，以降低病毒感染和转座子插入对基因的毒性作用 [4] 。

　　2 RNAi的发生机制

　　RNAi已经作为剔除基因功能的工具，在基因功能研究中得到广泛的应用，但RNAi的机制目前还没有完全清楚。RNAi的发生可归纳为以下几步:(1)细胞内形成dsRNA;(2)dsRNA被核酸酶(Dicer)切割成21～25nt的干扰性小RNA(siRNA);(3)由siRNA中的反义链指导形成一种核蛋白体，称RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC);(4)由RISC介导切割靶mRNA分子中与siR-NA反义链互补的区域，使转录后的mRNA不能翻译成蛋白质;(5)再以靶mRNA为模板，以siRNA为引物，在RNA依赖的RNA合成酶(RdRP)的作用下产生新的dsRNA，进行下一个循环的RNAi，从而使同源基因表达沉默。

　　虽然RNAi现象在许多生物中自然存在，但是在哺乳动物细胞中至今未发现有RNAi自然存在的证据。把长度超过30个核苷酸的dsRNA转染进入大多数哺乳动物细胞中后，会导致基因表达非特异性抑制 [5] 。可能的机制是，哺乳类动物细胞中可能还存在着dsRNA依赖性蛋白激酶(dsRNA dependent protein kinase，PKR)和2 ，5 寡腺苷酸合成酶腺苷酸聚合酶 [6，7] 。长链dsRNA进入细胞后，细胞内的病毒防御机制被激活。细胞内干扰素产生增加，蛋白激酶PKR被激活，活化的PKR进一步使翻译起始因子EIF2α磷酸化失活，最终造成翻译的停滞;2 ，5 寡腺苷酸聚合酶是非特异性核糖核酸酶RNaseL的辅因子，长链dsRNA激活2 ，5 寡腺苷酸聚合酶，然后RNaseL又导致非特异性RNA降解。

　　3 RNAi的特点

　　由极少的dsRNA就可以引起明显的基因敲除表型，由此可见RNAi具有特异性和高效性两个明显的特征。

　　当一段基因同源的dsRNA注入动物的胚胎时，它可以特异地在体内干扰相应基因的表达，其它基因即使与靶基因同属于一个基因家族都不会受到干扰。而且，在siRNA序列中配对的19、21nt中如果只改变一个核苷酸，就可以使该siRNA序列不对靶mRNA起作用，证明RNAi有高度特异性的。

　　RNA干扰作用具有很强的潜能，每个细胞只需要几个dsRNA就可以产生有效的干扰作用，尽管注入的dsRNA的浓度远远低于体内同源的mRNA水平，它却足以引起RNA干扰作用。可见，RNAi过程具有生物催化反应的高效性。

　　4 产生RNAi的方法

　　产生RNAi的方法主要有体外合成和体内合成siRNA法。Harbort

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