2 结 果
2.1 TF在人神经母细胞瘤细胞系SHEP 1及SKNSH中的表达水平 人神经母细胞瘤细胞系SHEP 1和SKNSH的TF表达水平以Western印迹法检测，可见SKNSH细胞中存在TF表达，但水平低下，而SHEP 1细胞中TF呈强表达(图1)。
2.2 TFpcDNA3表达载体在人神经母细胞瘤细胞中的转染及表达 本研究采用既往构建的TFpcDNA 3表达载体，以脂质体Lipofectamine2000介导转染SKNSH细胞48 h后，TF表达水平显著增高，转染质粒总量为2 μg/孔(图2)。
2.3 TF表达增强抑制阿霉素对SKNSH的细胞毒性 以TFpcDNA 3表达载体或对照pcDNA 3质粒分别转染SKNSH细胞，而后以不同浓度的阿霉素处理48 h，以WST法检测阿霉素的细胞毒性，结果显示转染TFpcDNA 3的SKNSH细胞与对照相比，存活细胞数显著增多，提示在TF表达增强的SKNSH细胞中，阿霉素的细胞毒性减弱(图3)。
2.4 TFpcDNA 3减弱阿霉素在SKNSH细胞中诱导的Caspase3及PARP活化 以TFpcDNA 3表达载体或对照pcDNA 3质粒分别转染SKNSH细胞，而后以1 μg/ml阿霉素处理4 h、8 h、24 h，Western印迹法结果显示，转染TFpcDNA 3的SKNSH细胞中，阿霉素诱导的Caspase3及PARP的裂解均较对照减弱(图4)。
2.5 TFpcDNA 3抑制阿霉素诱导的SKNSH细胞凋亡 以TFpcDNA 3表达载体或对照pcDNA 3质粒分别转染SKNSH细胞，而后以1 μg/ml的阿霉素处理24 h，经Hochest 33342染色，荧光显微镜下观察凋亡细胞数，结果显示转染TFpcDNA 3的SKNSH细胞凋亡数为134.33±21.00，对照细胞凋亡数为232.33±8.84(P<0.05)，提示TF表达上调的SKNSH细胞经阿霉素处理后，凋亡较对照细胞显著减少(图5)。
3 讨 论
组织因子(tissue factor,TF)是凝血途径的启动因子。近年来发现，TF不只是重要的凝血因子，还在肿瘤生长、侵袭和转移、血管新生、炎症、胚胎发育等多种病理生理过程中发挥调控作用[2,3,6]。TF促进肿瘤生长、侵袭和转移的非凝血功能与新近确认的TF信号转导受体特性密切相关[2]。TF作为跨膜糖蛋白，与其配体凝血因子Ⅶ(coagulation factor Ⅶ,FⅦ)或活化因子Ⅶ(activated FⅦ,FⅦ)结合，所形成的复合物可以诱导多种信号转导。TF增强肿瘤生长、侵袭及转移的机制较为复杂，现有研究认为与其增强肿瘤局部纤溶活性，影响细胞骨架系统，促进肿瘤血管新生等有关[7]。但是TF高表达影响肿瘤发生发展的机制并未完全得到阐释。凋亡是肿瘤发生的关键，抗肿瘤治疗化疗或放也主要是通过诱导凋亡杀伤肿瘤细胞，化疗药物如不能诱导肿瘤凋亡则可能导致抗肿瘤治疗的耐受或抵抗[8，9]。如前所述，TF表达水平与多种肿瘤的组织学分级及预后相关，TF表达水平高的肿瘤分化程度低、预后差。TF的异常表达是否干预肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，参与调控化疗药物诱导的肿瘤凋亡，籍此影响预后并未阐明。国外研究报道TF/FⅦ复合物能通过激活PI3K/Akt信号转导抑制去血清诱导的幼仓鼠肾细胞(BHKTF)凋亡，提供了TF参与凋亡调控的初步线索[10,11]。但TF表达在肿瘤凋亡中的作用并未阐明。本文以TFpcDNA 3表达载体在SKNSH细胞中显著上调TF表达，发现阿霉素对人神经母细胞瘤的细胞毒性随之减弱，提示TF基因上调可能抑制化疗药物对神经母细胞瘤细胞的杀伤作用。诱导凋亡是许多化疗药物杀伤肿瘤细胞的机制之一。Caspase3及聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(PARP)是阿霉素诱导凋亡的主要效应分子[12]。因此为了研究TF影响阿霉素对人神经母细胞瘤细胞毒性的机制，我们以TFpcDNA 3转染低表达TF的SKNSH细胞，随后观察其对Caspase3和PAPR裂解的影响，结果显示在TF表达增强的人神经母细胞瘤细胞中，阿霉素诱导的Caspase3和PAPR活化减弱;以Hochest 33342染色也检测到TF表达上调后阿霉素诱导的凋亡细胞数减少。由此初次提示，以基因转染上调人神经母细胞瘤细胞TF表达，可抑制阿霉素诱导的肿瘤细胞;TF在人神经母细胞瘤中的异常高表达可能抑制阿霉素诱导的肿瘤细胞凋亡，提示TF有可能提高肿瘤细胞对化疗药物的耐受性，籍此影响肿瘤的转归
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